歷經多年發展，嵌合抗原受體CAR-T細胞療法已成為癌癥治療的革命性方法，其中，CD19靶點藥物在治療B細胞惡性腫瘤方面更是取得了前所未有的成功，并于2017年獲得美國FDA批準。其中，CAR分子設計及病毒包裝是影響CAR-T細胞治療有效性的重要環節，在前幾期文章里，我們集中梳理了以下幾個要點：

• 介紹CAR結構及其設計原則
• 盤點CAR-T細胞治療的局限性及潛在風險
• 如何打破困局、提升治療效果的創新策略

今天結合具體的研究案例數據，為大家展示在實際的應用情境中，我們可以如何更好地了解進而優化CAR分子設計、載體構建及病毒包裝等一系列工藝流程。

CAR分子設計
CAR分子全稱為嵌合抗原受體，其結構包括信號肽分子，抗體來源的單鏈可變區、鉸鏈區、跨膜區，共刺激分子結構域、CD3ζ信號轉導域。

• scFv篩選：scFv親和力和特異性對CAR分子功能有重要影響，篩選合適的scFv十分重要
• 連接基團（Linker）的優化：設計不同長度的Linker，使V_H和V_L之間的靈活度增加，進而影響結合親和力
• 鉸鏈區（Hinge）的優化：設計不同長度的Hinge，增加抗原結合域的空間靈活度
• 共刺激結構域的選擇：可選擇不同的共刺激分子（如4-1BB或CD28等）
• 報告基因：可連接綠色熒光蛋白基因，表征CAR分子是否轉導成功

CAR分子結構示意圖
 

表1 CAR分子設計中常用原件

載體構建
在設計好CAR分子后，通常需要對其進行基因合成并亞克隆至慢病毒穿梭質粒上，構建后的其結構通常如圖所示。賽業生物可以提供多種現貨型的CAR慢病毒質粒載體庫，靶點包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等，且該載體庫還在不斷的豐富和更新中。
 

CAR慢病毒載體結構圖示

病毒包裝和純化
賽業生物在慢病毒制備方面具有多年的經驗，可以提供多樣化的慢病毒制備服務。我們使用了安全性高的第三代慢病毒包裝系統，其制備流程如圖所示。
 

慢病毒包裝技術路線

解決策略推薦
基于多年在腫瘤免疫領域的研究經驗，賽業生物可為CAR-T/其它細胞治療研究者提供專業的CAR分子設計及載體構建、CAR慢病毒制備、靶抗原穩轉細胞株構建等服務。

• 豐富的CAR分子設計經驗，可提供專業的各種定制化的CAR分子設計服務
• 豐富的CAR慢病毒質粒載體庫，可提供快速優質的服務
• 抗原高表達、高穩定性的穩轉細胞株構建服務
• 高滴度高純度的慢病毒制備
• 嚴格的質控標準

不僅如此，我們能給予你關于CAR-T/其他細胞治療研發的全方位支持，從抗體開發、CAR病毒制備、免疫細胞制備和表型檢測，到細胞模型與動物模型的構建、體外/體內藥效評價一應俱全。

服務案例

• CD19抗原慢病毒滴度檢測

將表達CD19抗原的慢病毒純化液進行梯度稀釋（0.01、0.1、1、10μL四個梯度），分別加入到相同數量的293T細胞中，72小時后流式檢測293T細胞陽性率(即被慢病毒感染的293T細胞占細胞總數的百分比)，進而計算慢病毒的轉導滴度。如圖所示，CD19抗原陽性細胞的數量隨轉染病毒梯度的增加而逐漸升高，表明該慢病毒有良好的感染活性，并計算病毒滴度為：1.4×10⁸ TU/mL。
 

CD19抗原慢病毒滴度檢測結果
 

• CD19-293T穩轉細胞株構建

使用上述CD19抗原慢病毒轉染293T細胞，經過多輪篩選，得到CD19抗原高度均一表達的CD19-293T穩轉細胞。
 

CD19-293T細胞CD19抗原陽性率檢測結果
 

• FMC63 CAR慢病毒滴度檢測

我們設計了如下結構的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子，并將其構建慢病毒載體上，進行慢病毒制備。采用上述方法檢測FMC63 CAR慢病毒滴度，病毒滴度約為：4.33×10⁸ TU/mL。
 

FMC63 CAR分子結構
 

FMC63 CAR慢病毒滴度檢測結果