引言

朊病毒是一類會引發人類和動物腦部蛋白質異常折疊的可傳播病原體。感染會導致腦損傷，且往往是致命的。此類神經退行性疾病的實例包括羊瘙癢癥、瘋牛�。ㄅ：＞d狀腦�。┖涂搜哦�氏病。

以前，研究朊病毒需要進行長時間的生物測定，對受感染的動物進行長時間（1-6 個月）的研究。這種方法既費時，而且飼養感染動物的成本也很高。蒙大拿州漢密爾頓的落基山實驗室研究開發了一種新的朊病毒接種測定法，稱為實時震蕩誘導轉化測定法（RT-QuIC），可對受感染樣本中的朊病毒水平進行終點定量測定。與以往的方法相比，這種檢測方法速度更快，通量更高。該測定可在短短 20 小時內完成，其靈敏度不亞于甚至高于全動物模型。

BMG LABTECH的FLUOstar Omega是唯/一具備長時間震蕩和培養微孔板的酶標儀，這得益于其堅固的“德國制造”結構。RT-QuIC樣本每隔15分鐘測量一次，共計20-68小時，期間交替震蕩1分鐘和靜置1分鐘。我們開發了一個軟件腳本，用于控制激活測定所需的振蕩和靜置時間。

檢測原理

RT-QuIC 檢測法用于估算朊病毒接種的相對數量。該檢測法通過測量樣本的連續稀釋，統計估算接種劑量（SD）。在該檢測中，極少量的傳染性朊病毒會被添加到正常的朊病毒蛋白中，從而引發或導致朊病毒蛋白發生類似疾病的錯誤折疊。測定方法是通過測量樣本的系列稀釋度并確定接種活性損失（SD50），即終點稀釋度來進行量化。

實驗步驟

在整個 20-68 小時期間，儀器設置為在 42°C 下恒溫孵育。實驗編寫了兩個測試運行協議的腳本。第一個協議設置為振蕩板一分鐘，然后靜置一分鐘；第二個協議設置為每 15 分鐘使用底部光學鏡進行一次熒光終點測量。熒光染料硫黃素 T（ThT）被用作朊病毒接種標記。將 ThT 添加到重組朊病毒蛋白中，當發生聚合反應時，ThT 就會與朊病毒蛋白結合，從而導致熒光隨著時間的推移而增加。

儀器設置

熒光終點 - 底部讀數

分析

斯皮爾曼-凱伯（Spearman-Kärber）分析法與生物測定的 50%致死劑量（LD50 ）類似，用于估算每克組織中50%的孔出現硫黃素T（ThT）陽性反應的播種劑量或稀釋倍數（SD50/g）。在進行 Spearman-Kärber 分析時，選擇的稀釋系列中至少有一個稀釋度的 ThT 陽性率為 100%，以及一個稀釋度的 ThT 陽性率為 0%。

結果與討論

使用軟件腳本對RT-QuIC檢測進行了20至68小時的測量，數據取自8個重復孔的相對熒光單位平均值。每個圖表僅顯示每45分鐘的數據。

FLUOstar Omega酶標儀除了線性振蕩和軌道振蕩外，還能以獨特的雙軌道振蕩模式進行振蕩。在整個測量期間，孵育溫度保持在42°C。Omega系列的高品質設計和堅固的制造使研究人員能夠連續測量數天，而不會中斷振蕩或產生溫度波動。數據被不間斷地收集并輸出到BMG LABTECH的數據分析軟件（MARS）和Excel中。

圖 1 和圖 2 展示了 RT-QuIC 檢測法與倉鼠豚鼠腦勻漿（BHs）的關系。圖 1 使用的是接種后 80-85 天（DPI）的倉鼠腦勻漿樣本，而圖 2 使用的是接種后 10 天的倉鼠腦勻漿樣本。

圖 1：RT-QuIC 靈敏度：對 263K 倉鼠腦勻漿稀釋液的分析。

 
50% 接種劑量（SD50 ）是指在半數重復孔中產生足夠增強的 ThT 熒光的量。在本例中，用 10E-9 稀釋的刮傷病 BH 儲存液（深藍線）的 2 μl 等分試樣（接種量）就能達到近似的 SD50 。因此，Spearman-Kärber 估計的 SD50 /2μL 為 10E9.1，SD50 /g 為 10E12。該 SD50 的對數（~11）與生物測定中發現的 LD50 的對數（~10）非常吻合。

圖 2：對三種 263K 接種臨床前注射后 10 天的倉鼠 BH 進行 RT-QuIC 終點稀釋分析。

在此情況下，約50%的播種劑量（SD50）通過2 μl的10E−5稀釋度的瘙癢癥接種后10天263K BH原液（綠色曲線）實現。其SD50/2μL為10E5.5，SD50/克組織為10E8.2。

正如預期，接種后85天（DPI）樣本的SD50/克組織（10E12）高于接種后10天的樣本（10E8.2），因為有更長的發病時間。這些RT-QuIC結果與生物測定結果高度相關。數據表明，RT-QuIC檢測可視為一種比整動物生物測定更快速、更高通量的替代方法，同時也表明接種后僅十天的動物樣本即可用該方法進行檢測。

結論
多功能酶標儀

使用RT-QuIC檢測法和酶標儀可以更快、更高效地測量朊病毒接種。一些已證實可用RT-QuIC檢測的傳染性海綿狀腦病包括倉鼠和綿羊的癢病、鹿的慢性消耗性疾病、克雅氏�。–JD）和牛海綿狀腦病（BSE）。這種檢測方法比以往的生物檢測方法更快、更靈敏。BMG LABTECH的Omega系列酶標儀功能強大且堅固耐用，能夠承受這種檢測方法所需的連續多日高速震動。

使用FLUOstar Omega的優勢包括：

• 更快、更高通量的朊病毒接種監測檢測方法
• 先進的酶標儀功能，包括震動和溫度控制，是檢測有效性的關鍵
• 20-68小時內每15分鐘進行一次熒光底部讀數測量

 
有關RT-QuIC檢測的更多詳情，請查看科學講座“優化RT-QuIC檢測的靈敏度和特異性”。科羅拉多州立大學的Davin Henderson博士在此分析了使用RT-QuIC檢測朊病毒時需要考慮的重要因素。

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