炎癥小體是一種大分子蛋白質復合物，當細胞遇到病原體或無菌損傷時，它負責控制一系列炎癥相關蛋白的加工。NLRP3炎癥小體廣泛表達，可被各種刺激激活。NLRP3炎癥小體的激活包括經典和非經典通路。經典通路誘導caspase-1激活，促使IL-1β/IL-18活化。

小鼠caspase-11或人類對應的caspase-4則啟動了非經典的炎癥小體信號通路。它們可以識別細胞質中的脂多糖（LPS），引起gasdermin D（GSDMD）活化，導致細胞焦亡，同時激活NLRP3炎癥小體，引發IL-1β釋放。這種免疫反應是宿主應對病原體感染時的重要一環。不過，caspase-11具體是通過何種機制引起NLRP3的活化，目前還有待查明。

北京大學醫學部基礎醫學院夏朋延研究團隊與中科院微生物所王碩研究團隊近日對非經典NLRP3炎癥小體激活通路進行了深入研究。他們發現孤兒受體Nur77與胞內LPS結合并激活非經典通路。這項成果于2023年3月30日發表在《Immunity》雜志上。
 

圖片來源：《Immunity》
（https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.03.003）

研究材料與方法
為了研究非經典NLRP3炎癥小體激活通路，研究人員使用了多種基因敲除小鼠，包括Nr4a1^–/–、Nlrp3^–/–、Casp4^–/–、Gsdmd^–/–、Aim2^–/–和Tlr4^–/–（均由賽業生物提供）。研究人員從這些小鼠中獲取BMDM細胞，或直接開展研究。他們采用pull-down實驗來分析多個組分的相互作用，并采用酵母雙雜交和免疫沉淀實驗來分析Nur77與NLRP3的結合。

技術路線
01 質譜分析篩選出Nur77是LPS的胞內結合蛋白
02 一系列實驗證實Nur77能夠與NLRP3結合，但需要LPS和dsDNA同時存在
03 dsDNA的來源是線粒體，需要GSDMD在線粒體上打孔
04 Nur77加劇了宿主對內毒素的反應

研究結果
1.Nur77是LPS的胞內受體
為了識別LPS的胞內結合蛋白，研究人員對骨髓來源的巨噬細胞（iBMDM）進行質譜分析。除了caspase-11，還有9種蛋白也是推定的LPS結合對象。之后他們利用CRISPR-Cas9技術生成了缺失這些蛋白的iBMDM細胞，發現只有缺失Casp11（編碼caspase-1）和Nr4a1（編碼核受體Nur77）的細胞在LPS刺激下無法分泌IL-1β，這表明Nur77可能在非經典炎癥小體信號通路中起作用。

他們從Nr4a1^-/-小鼠（賽業生物提供）中生成了原代BMDM細胞。在轉染LPS后，Nr4a1^-/- BMDM細胞的caspase-1沒有活化，而caspase-11或GSDMD活化不受影響。同時，Nr4a1^-/-細胞的IL-1β分泌減少，但細胞焦亡不受影響。這些結果表明，Nur77對非經典NLRP3炎癥小體的激活至關重要。

研究人員懷疑，Nur77是胞內LPS的真正傳感器。非變性凝膠電泳分析發現，與LPS孵育的Nur77遷移得比單獨的Nur77慢，表明這兩個分子之間存在直接結合。生物素標記的LPS可在pull-down分析中沉淀重組Nur77，進一步表明Nur77是LPS的胞內受體。此外，他們還確定了Nur77的C端結構域參與了與LPS的結合，缺乏第524-547位氨基酸的Nur77無法與LPS結合。

2.Nur77在LPS和dsDNA的幫助下激活NLRP3炎癥小體
基于這些結果，研究人員假設Nur77在caspase-11和GSDMD下游的NLRP3炎癥小體激活中發揮了作用。為了研究具體的分子機制，他們開展了酵母雙雜交實驗，證實Nur771-287與NLRP3的LRR結構域存在相互作用。在HEK293T細胞中，他們通過免疫共沉淀實驗觀察到Nur771-357與全長NLRP3結合，但沒有觀察到全長Nur77與全長NLRP3的結合。經過一系列實驗，他們發現只有在LPS和包含NBRE的dsDNA存在時，Nur77才能與NLRP3結合（圖1）。在受到LPS刺激的BMDM細胞中，他們通過免疫熒光染色觀察到Nur77和NLRP3是共定位的。
 

Nur77在LPS和dsDNA存在時與NLRP3結合^[1]

那么，這個dsDNA的來源是不是線粒體？為了確定GSDMD是否能夠導致巨噬細胞中線粒體DNA的釋放，研究人員將LPS轉染到BMDM細胞中，并對各個細胞組分進行分離。結果表明，裂解的GSDMD存在于線粒體部分，且釋放到胞質中的線粒體dsDNA增加。同時，線粒體DNA的耗盡會導致BMDM細胞在LPS刺激后的NLRP3炎癥小體激活減少。在Nr4a1^-/- BMDM細胞中，若釋放線粒體DNA的通道被抑制，則非經典NLRP3炎癥小體的激活受到影響。這些結果表明，GSDMD在線粒體上打孔，將線粒體DNA釋放到胞漿中，這對于Nur77的活化至關重要。

考慮到GSDMD在非經典NLRP3炎癥小體的激活中起著關鍵作用，他們利用Gsdmd^-/- BMDM細胞開展實驗，以確定Nur77與NLRP3之間的關系。他們發現，Gsdmd^-/-細胞在受到LPS刺激后，Nur77不再與NLRP3結合，也未觀察到Nur77與線粒體DNA的結合。同樣地，在Casp11^-/- BMDM細胞中，Nur77與NLRP3之間的結合也受到影響（圖2）。因此，Nur77需要caspase-11來加工GSDMD以激活非經典的NLRP3炎癥小體。缺乏DNA結合域或LPS結合位點的Nur77不能促進NLRP3的激活。
 

Nur77對NLRP3的激活依賴caspase-11和GSDMD^[1]

3.Nur77缺乏減輕宿主對內毒素的反應
最后，研究人員分析了Nur77在膿毒癥中的作用。他們用poly（I：C）對野生型、Nr4a1-/-、Nlrp3-/-和Casp11-/-小鼠（賽業生物提供）進行預處理后注射LPS，發現Nr4a1^-/-小鼠血清中的IL-1β水平降低，與Nlrp3^-/-小鼠相似。分離小鼠的腹膜巨噬細胞后發現，Nr4a1缺失不影響細胞焦亡。在注射致死劑量的LPS后，Nr4a1^-/-小鼠存活時間更長。這些結果表明，Nur77會加劇宿主對內毒素的反應。

研究結論

Nur77與LPS結合激活非經典NLRP3炎癥小體的示意圖^[1]

總的來說，這項研究表明Nur77作為細胞內的LPS傳感器，與線粒體DNA和LPS結合，激活非經典NLRP3炎癥小體通路（圖3）。作者認為，Nur77為caspase-11的激活和下游NLRP3炎癥小體的形成搭建了橋梁，有望為炎癥性疾病和膿毒癥的治療提供靶點。

原文檢索：

[1]Zhu F, Ma J, Li W et al., The orphan receptor Nur77 binds cytoplasmic LPS to activate the non-canonical NLRP3 inflammasome. Immunity (2023), https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.03.003