YTHDF3+/−小鼠在解析m6A閱讀器YTHDF3誘導自噬的機制中的應用
自噬是一種進化上保守的機制，有助于真核細胞維持平衡和更新。它參與調控了多個重要的細胞過程，包括維持細胞干性、促進胚胎發育、形成固有免疫，并影響衰老和長壽。傳統的觀點認為，自噬是蛋白質水平上的一系列細胞質事件，但近年來的證據表明，細胞核轉錄和表觀遺傳調控也對這一過程有深遠的影響。
在細胞適應因營養缺乏及其他代謝紊亂引起的代謝變化時，自噬也發揮著關鍵的作用。一些營養傳感器被證明可以調節自噬，從而維持細胞代謝和能量穩態。然而，m6A等表觀轉錄組修飾在饑餓誘導自噬的調節中發揮什么作用，目前還不清楚。
近日，南方醫科大學等機構的研究人員在《Nature Communications》雜志上發表論文，首次揭示了m6A閱讀器YTHDF3作為營養反應器調節自噬誘導的作用和機制，為RNA轉錄后修飾應對營養缺乏應激的范式提供了新見解。
圖片來源：Nature Communications
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）。利用賽業生物提供的YTHDF3+/−小鼠，他們構建了YTHDF3−/−小鼠胚胎。在整個實驗過程中，他們使用了基于LC-MS的蛋白質組分析、RNA免疫共沉淀測序分析（RIP-seq）和MeRIP-seq分析、免疫熒光染色和自噬流分析等。他們還通過LC-MS/MS和m6A斑點印跡測定了m6A修飾水平。
技術路線
01 通過蛋白質組學分析發現饑餓狀態下的YTHDF3蛋白水平升高
02 通過RNA干擾實驗證實YTHDF3上調是自噬所必需的
03 在分析m6A水平后發現饑餓處理提高了m6A修飾水平，而YTHDF3需要METTL3介導的m6A修飾來促進自噬
04 通過RIP-seq和MeRIP-seq等分析發現FOXO3是YTHDF3促進自噬的關鍵功能靶點
05 YTHDF3與FOXO3 mRNA終止密碼子附近的m6A修飾位點結合，然后招募eIF3a和eIF4B來促進FOXO3翻譯
研究結果
1.YTHDF3上調是自噬誘導所必需的
為了鑒定與自噬相關的表觀轉錄組分子，研究人員對營養缺乏狀態下的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）開展了蛋白質組學分析。有趣的是，他們發現m6A閱讀器YTHDF3的水平顯著升高。
為了分析YTHDF3誘導是否與自噬發生有關，他們利用shRNA載體來敲低MEF中的YTHDF3的表達，發現自噬標志物LC3-II水平下降，而自噬受體蛋白p62積累，表明自噬流降低。挽救實驗表明，YTHDF3的異位表達能夠提高LC3-II水平，并加快p62降解。他們還利用賽業生物提供的YTHDF3+/−小鼠繁育YTHDF3−/−小鼠胚胎并獲得了YTHDF3−/− MEF細胞，發現YTHDF3缺失導致MEF細胞中自噬體和自噬性溶酶體數量大幅減少。這些數據表明，YTHDF3上調是營養缺乏期間的自噬誘導所必需的。此外，后續的分析表明，YTHDF3缺失損害了自噬體形成和溶酶體功能。
2.YTHDF3需要m6A修飾來促進自噬
考慮到YTHDF3是m6A閱讀器，研究人員接著探索了YTHDF3是否需要m6A修飾來促進自噬。他們發現，m6A修飾在營養缺乏時顯著增加，表明mRNA的m6A水平在自噬誘導期間升高。在分析m6A修飾的書寫器（負責添加修飾）和擦除器（負責去除修飾）后，他們發現只有書寫器METTL3在營養缺乏后顯著升高（圖1）。
圖1 YTHDF3需要METTL3介導的m6A修飾來促進自噬[1]
研究人員推測，METTL3介導的m6A修飾可能是YTHDF3促進自噬的關鍵。他們在過表達YTHDF3的MEF中敲低METTL3，發現饑餓誘導的LC3-II積累和p62降解均顯著減弱。之后他們將野生型和催化活性缺失突變型METTL3重新引入METTL3沉默細胞中，發現野生型METTL3可以挽救沉默細胞的自噬缺陷，而突變型則不行。這些數據表明，YTHDF3需要METTL3介導的m6A修飾來促進自噬。
3.FOXO3是YTHDF3促進自噬的重要靶點
接下來，研究人員試圖鑒定在營養缺乏時與YTHDF3差異結合的mRNA。通過兩次YTHDF3 RIP-seq分析，他們發現在饑餓條件下有3424個結合上調的轉錄本和1814個結合下調的轉錄本。在分析這些結合位點后，發現m6A峰顯著富集于蛋白質編碼序列（CDS）和3’UTR中的核心基序‘GGAC’上，這與已發表的研究中m6A峰的分布模式一致。因此，他們推測在營養缺乏時與YTHDF3差異結合的mRNA主要是m6A修飾的（圖2）。
為了確定營養缺乏時與YTHDF3結合的潛在m6A甲基化靶點，他們將營養缺乏時YTHDF3 RIP-seq的上調峰與MeRIP-seq的上調峰相疊加，獲得了86個峰，其中7個基因被注釋到自噬通路。在這些基因中，FOXO3是文獻報道的調節自噬的最重要轉錄因子之一。為了驗證YTHDF3-FOXO3 mRNA的相互作用是否依賴于METTL3介導的m6A修飾，他們在MEF中敲低了METTL3，發現FOXO3轉錄本的CDS和3’UTR區域的m6A修飾水平均下降。相應地，YTHDF3與FOXO3 mRNA的結合也減少。之后，他們還利用含有FOXO3不同序列的探針開展EMSA實驗，表明一旦從RNA探針中去除m6A修飾，YTHDF3與探針之間的相互作用就顯著減弱。這些結果表明，在營養缺乏期間，METTL3介導的m6A高甲基化是YTHDF3-FOXO3 mRNA相互作用所必需的。
圖2 YTHDF3識別饑餓誘導的FOXO3 mRNA的m6A高甲基化[1]
之后，通過進一步的分析，研究人員發現YTHDF3的作用可能是調節FOXO3的翻譯，而不是FOXO3的翻譯后修飾（如磷酸化）。他們發現，YTHDF3以METTL3依賴性的方式調節FOXO3的表達，并改變FOXO3靶向的自噬基因的表達。他們還在YTHDF3缺陷型細胞中異位表達了FOXO3，發現LC3-II的表達得到恢復，p62逐漸降解。這些結果表明，FOXO3是YTHDF3促進自噬的關鍵功能靶點。
4.YTHDF3促進FOXO3的翻譯，但不影響其mRNA的穩定性
研究人員發現，敲低YTHDF3并不影響FOXO3 mRNA的水平，表明YTHDF3可能對FOXO3的翻譯有影響。YTHDF3已被報道通過與40S和60S核糖體亞基相互作用促進RNA的翻譯，于是他們開展了多聚核糖體分析，發現在YTHDF3缺陷型細胞中，FOXO3 mRNA在多聚核糖體中的水平低于對照細胞，表明YTHDF3缺失減弱了FOXO3翻譯。通過突變分析，他們進一步確認了FOXO3-CDS終止密碼子附近的m6A位點在YTHDF3促進FOXO3翻譯時發揮關鍵作用。同樣地，FOXO3-3’ UTR區域終止密碼子附近的m6A位點也參與了FOXO3翻譯調節。
翻譯控制通常發生在起始階段。在開展co-IP LC-MS/MS分析后，研究人員注意到多個翻譯起始因子與YTHDF3存在相互作用。其中，eIF3a和eIF4B是營養缺乏時最明顯富集的。通過不同核糖體組分的Western blot分析和分子對接模型分析，他們認為eIF3a、eIF4B和YTHDF3之間很可能存在蛋白質相互作用。在敲低eIF3a或eIF4B后，FOXO3蛋白水平降低，表明YTHDF3可能與eIF3a和eIF4B相互作用來促進FOXO3翻譯。
研究結論
圖3 YTHDF3誘導自噬的可能機制[1]
總的來說，這項研究揭示了表觀轉錄組學與自噬之間的重要關聯。一系列的證據表明，m6A閱讀器YTHDF3作為營養反應器，與FOXO3 mRNA終止密碼子附近的m6A修飾位點結合，然后招募eIF來迅速促進FOXO3翻譯，并進一步從轉錄上激活一系列核心自噬基因，從而促進自噬（圖3）。
原文檢索：
[1] Hao, W., Dian, M., Zhou, Y. et al. Autophagy induction promoted by m6A reader YTHDF3 through translation upregulation of FOXO3 mRNA. Nat Commun 13, 5845 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32963-0
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YTHDF3 KO小鼠
品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf3em1Cya
品系編號：
KOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA
產品編號：
S-KO-06231
應用方向：
信號轉導,RNA剪接,蛋白質代謝,RNA結合蛋白,代謝研究,生理系統
打靶方案：
YTHDF3 Flox小鼠
品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf3em1(flox)Cya
品系編號：
CKOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA
產品編號：
S-CKO-07230
應用方向：
代謝研究,蛋白質代謝,信號轉導,RNA剪接,RNA結合蛋白
打靶方案：
