新冠變異株如何逃避免疫應答？人ACE2轉基因小鼠助力揭示免疫逃逸機制
近期，國家衛(wèi)健委發(fā)布了兩條消息，一是將新型冠狀病毒肺炎更名為新型冠狀病毒感染；二是對新型冠狀病毒感染實施“乙類乙管”，隨著全國各地陸續(xù)放寬限制，新冠病毒感染人數(shù)直線激增，中國進入“共存時代”。新冠病毒（SARS-CoV-2）為什么難以對付？這是由于在自然感染和疫苗接種帶來的免疫壓力下，病毒出現(xiàn)了多個變異株，能夠逃避抗體的中和作用。
帶有L452R突變的Delta變異株出現(xiàn)后，已迅速取代Alpha、Beta、Gamma和Kappa等變異株成為全球主要的流行毒株。早期流行的Omicron變異株BA.1對抗體敏感，但包含L452R的亞型迅速出現(xiàn)并擴散至全球多個國家和地區(qū)。
廣州生物醫(yī)藥與健康研究院領導的研究團隊近日鑒定了SARS-CoV-2感染引起的群體免疫應答，并探討了SARS-CoV-2變異株如何出現(xiàn)并逃避宿主的免疫應答。這項成果于2022年9月下旬發(fā)表在《Nature Microbiology》雜志上。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員從6例新冠康復期患者身上采集了全血樣本，并在Expi293F細胞和人ACE2轉基因小鼠（由賽業(yè)生物提供）上開展實驗。他們構建了噬菌體展示文庫，并分離出與刺突蛋白RBD結合的抗體。他們通過冷凍電鏡分析了抗原與抗體的結合，并通過生物膜干涉技術（BLI）測定了結合動力學和親和力以及競爭性結合。
技術路線
01 構建噬菌體展示文庫并分離與刺突蛋白RBD結合的抗體
02 通過冷凍電鏡分析R1-32與刺突蛋白形成復合物的結構
03 通過抗體與刺突蛋白突變體的結合分析RBD替換對免疫逃逸的影響
04 鑒定SARS-CoV-2感染引起的群體免疫應答
研究結果
1.抗體R1-32中和了SARS-CoV-2變異株
研究人員對6例新冠恢復期患者外周血單核細胞中的抗體基因進行噬菌體展示，分離出6種與刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）具有高親和力的抗體。他們發(fā)現(xiàn)，R1-32抗體表現(xiàn)出最強的假病毒中和活性（IC90=9.95nM）。R1-32對Beta變異株和Omicron BA.1假病毒都保持了良好的中和作用，但對Delta變異株的中和作用被大大削弱。在人ACE2轉基因小鼠（由賽業(yè)生物提供）上開展的實驗表明，R1-32對SARS-CoV-2野生型病毒感染具有保護作用。
通過冷凍電鏡分析，研究人員發(fā)現(xiàn)R1-32 Fab從刺突蛋白N端結構域（NTD）的上方接近并與RBD結合。通過改變Fab的量，他們發(fā)現(xiàn)R1-32結合促進RBD打開。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，R1-32的HCDR2和HCDR3介導了它與RBD的互作（圖1）。HCDR2表位包含疏水殘基L452、F490和L492，而多個新冠病毒變異株的HCDR2表位發(fā)生氨基酸替換，使R1-32與RBD結合的親和力大大降低，表明HCDR2表位內的L452和F490對抗體結合極其重要。
圖1 R1-32與SARS-CoV-2刺突蛋白形成復合物的結構
當RBD處于down構象時，R1-32表位被部分掩蓋，只有HCDR2表位完全暴露。這個半隱蔽的表位解釋了為什么R1-32結合促使RBD采用up構象。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與R1-32孵育的天然刺突蛋白分解成較小的結構，表明R1-32結合產生了不穩(wěn)定的開放刺突蛋白結構。研究人員認為，R1-32很有可能通過破壞刺突蛋白的結構來抑制病毒細胞進入，從而中和病毒。
此外，他們發(fā)現(xiàn)R1-32及相關的FC08和52抗體均使用VH1-69基因作為重鏈可變區(qū)。它們以非常相似的方式與RBD結合，代表了一類獨特的RBD靶向抗體。
2.L452的RBD替換與免疫逃逸有關
Delta變異株（L452R/T478K）在印度出現(xiàn)后取代Kappa等多個變異株成為流行毒株。研究人員發(fā)現(xiàn)，Delta變異株中的T478K對抗體結合沒有影響，而L452R大大降低了R1-32和FC08與RBD的結合�；谶@些結果，他們假設HCDR2表位452位點的替換可以逃避R1-32樣抗體。
最早出現(xiàn)的Omicron變異株BA.1在452和490位不包含任何替換，與此一致，他們發(fā)現(xiàn)R1-32與Omicron BA.1 RBD/刺突蛋白三聚體以高親和力結合，并中和Omicron BA.1假病毒。
研究人員推測R1-32樣抗體可能在人群中很常見，于是搜索了20名COVID-19患者和25名健康供體的免疫球蛋白重鏈（IgH）庫。他們在50%的COVID-19患者和24%的健康供體中檢測到R1-32樣IgH序列。COVID-19患者IGHV1-69編碼庫中的R1-32樣IgH序列百分比顯著高于健康供體，表明在暴露于SARS-CoV-2后該抗體譜系有明顯的克隆擴增（圖2）。
圖2 R1-32樣抗體在健康個體和COVID-19患者中的高發(fā)生率
研究人員還提到，盡管Omicron BA.1亞型對R1-32抗體中和敏感，但之后出現(xiàn)的亞型通過L452替換而出現(xiàn)大規(guī)模免疫逃逸。這些亞型的迅速出現(xiàn)和擴散表明R1-32樣抗體對SARS-CoV-2病毒施加了強大的免疫壓力
研究結論
在這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)HCDR2表位452和490位點的反復替換與群體抗體應答的免疫逃逸有關。這些替換（包括Delta變異株中的L452R）破壞了疏水性HCDR2介導的相互作用，從而破壞了抗體與抗原的結合，讓新冠變異株能夠逃逸。他們認為應當持續(xù)監(jiān)測這些突變熱點。
參考文獻：
[1] He, P., Liu, B., Gao, X. et al. SARS-CoV-2 Delta and Omicron variants evade population antibody response by mutations in a single spike epitope. Nat Microbiol 7, 1635–1649 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01235-4
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