近日，中南大學湘雅醫院產科張衛社教授、戴鐳博士后領導的產前診斷研究團隊在美國腎病學學會官方期刊《Journal of the American Society of Nephrology》上發表了題為“A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans”的文章，影響因子10.12，為國際上首次發現腎連蛋白（NPNT）基因是導致人類雙腎缺如的致病基因。戴鐳博士后為論文獨立第一作者，張衛社教授為論文獨立通訊作者。
 

先天性腎尿路畸形是一種常見的出生缺陷，新生兒的發病率約為2/1000，在所有兒童先天性畸形中占30-40%。雙腎缺如（BRA）則是先天性腎尿路畸形中最嚴重的類型，通常會導致圍產期死亡或終止妊娠。盡管人們認為遺傳因素扮演了重要角色，但仍有大部分病例的確切原因得不到診斷。

全外顯子組測序發現NPNT突變
在該研究中，一對近親夫妻連續三次妊娠都顯示雙腎未顯示、羊水過少，懷疑胎兒患有雙腎缺如而不得不引產，并通過引產胎兒的病理解剖得到證實。為了確定這背后的遺傳因素，研究人員對這個家庭中的多名成員開展全外顯子組測序（WES）（圖1）。
 

圖1. NPNT突變的家族譜系圖

研究人員發現在兩個異常胎兒共享了35.05 Mb的基因組區域，并從那些共有的連續性純合片段（ROH）中發現了310個變異。在去除了InterVar預測為良性和可能良性的變異后，剩下NPNT基因第8個外顯子中的純合移碼突變（c.777dup/p.Lys260*）。因此研究人員認為，NPNT可能是導致雙腎缺如的第一候選基因。

腎連蛋白（Nephronectin，NPNT）對腎臟發育至關重要，小鼠中Npnt的敲除往往會導致腎缺如或發育不全。因此，NPNT被認為是雙腎缺如的可能致病基因，但以往的研究NPNT突變并未在腎發育不全患者中報道。研究人員通過軟件預測，移碼突變可能導致下一個密碼子形成終止密碼子，從而產生截短蛋白，只有260個氨基酸。該預測通過體外過表達實驗得到了證實。

在過表達WT-NPNT和K260ter-NPNT的HEK293T細胞中，研究人員發現K260ter-NPNT mRNA表達水平顯著低于野生型對照。使用Flag標簽抗體的Western blot分析在K260ter-NPNT轉染細胞中檢測到35 Kda的截短蛋白，且表達量降低，而針對突變下游表位的NPNT抗體則沒有檢測到截短蛋白，與預期一致（圖2）。這些結果證實，p.Lys260* 突變導致無義介導的mRNA降解和截短蛋白的產生。
 

圖2. WT-NPNT和K260ter-NPNT在293T細胞中的過表達

Npnt突變小鼠顯示腎發育不全
研究人員委托賽業生物，構建了帶有Npnt-c.777dup/p.Lys260*突變的基因敲入小鼠，并通過雜合小鼠的交配產生純合突變體（NpntK260*/K260*）。利用Npnt抗體對純合小鼠的肺組織開展WB分析，未檢測到任何NPNT蛋白（圖3），表明引入小鼠模型的突變影響了Npnt蛋白的表達，與人類相似。
 

圖3. 模擬純合移碼突變的基因敲入小鼠的構建

所有小鼠出生時都有著正常的外觀（大小、體重且無外部缺陷），但純合小鼠在出生后第二天死亡。研究人員解剖后發現，絕大多數純合小鼠的兩側都沒有腎臟（14/15），伴隨著輸尿管的缺失；剩下的一只NpntK260*/K260*小鼠有兩個尺寸較小的原始腎臟。組織學分析顯示，純合原始腎臟中的腎單位發育停滯，而其他組織沒有明顯的形態異常。

有意思的是，NpntK260*/K260*小鼠與Npnt−/−小鼠的表型存在一些差異。NpntK260*/K260*小鼠的雙腎缺如頻率高達93.3%，而以往報告的Npnt−/−小鼠頻率為46%。作者認為，可能的原因在于另一種配體在功能上補償了Npnt−/−小鼠缺失的Npnt蛋白。在NpntK260*/K260*小鼠中，截短的Npnt蛋白殘基可能對替代配體產生負面影響。另一種可能的解釋是遺傳背景不同，近交系小鼠表現出較低的性狀可變性。

總結
這項研究表明，該患病家庭中出現的雙等位基因功能缺失NPNT突變是造成人類雙腎缺如的原因。模擬該突變的小鼠模型再現了雙腎缺如的臨床表型。這些結果揭示了雙腎缺如的新致病基因，為雙腎缺如家族的遺傳診斷、產前診斷和胚胎植入前診斷提供了新的靶點。

產科主任張衛社教授領導的中南大學湘雅醫院產前診斷中心經四年建設，已成為中南地區技術力量最強、開展產前診斷項目最多的省級產前診斷中心之一。中心致力于復雜胎兒宮內異常診治，罕見病的遺傳學診斷、產前診斷及科研工作，每年接待大量的疑難會診及轉診工作，為降低湖南省及周邊省市地區出生人口缺陷率，提高缺陷兒的救治率，挽救珍貴兒的生命起到了關鍵作用。

原文檢索：
Lei Dai, Jingzhi Li, Liangqun Xie, et al. A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans. JASN August 2021, 32 (8) 1871-1879; DOI: https://doi.org/10.1681/ASN.2020121762

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