英國制藥巨頭阿斯利康（AstraZeneca）公司在genOway的PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點人源化小鼠（賽業生物已與genOway達成戰略合作伙伴關系并引進該小鼠）上測試了一款新型的同時靶向PD-1和CTLA-4的單價雙特異性抗體MEDI5752，研究結果發表在了Cancer Discovery上。

背景

免疫檢查點療法是近來腫瘤治療的熱門領域，其中，靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抑制劑都已獲批上市，并取得了顯著成果。此外，PD-1和CTLA-4抑制劑的聯用也在包括黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌在內的多種腫瘤中表現出了顯著增強的抗腫瘤效果。但其中，CTLA-4抑制劑的免疫相關不良事件（(immune-relatedadverse events，irAEs）也一直是個令人頭疼的問題，包括常見的胃腸道毒性、皮膚毒性和肝臟毒性等。為了解決這個問題，AstraZeneca公司研發了一款同時靶向PD-1和CTLA-4的單價雙特異性抗體MEDI5752。MEDI5752是一種能優先抑制PD-1+ T細胞上CTLA-4的新型免疫抑制劑。

與傳統的PD-1/CTLA-4雙抗不同，MEDI5752能引發對PD-1的快速內化和降解，并能優先定位和聚積在腫瘤部位。MEDI5752目前正處于phase I 階段(NCT03530397)，并在兩名晚期實體瘤患者中觀測到了部分緩解（partial response, PR）。

此外，值得一提的是，AstraZeneca有一款最早由輝瑞 （Pfizer）公司研發是anti-CTLA-4全人源化單克隆抗體Tremelimumab。但由于Tremelimumab在臨床試驗中一直表現不佳，直至目前為止，還沒有獲批治療任何癌癥。AstraZeneca也在嘗試將Tremelimumab與其他免疫檢查點抑制劑藥物聯用，例如，Tremelimumab與Imfinzi（anti-PD-L1）聯用來治療非小細胞肺癌（III期NEPTUNE試驗失敗）、晚期膀胱癌（III期DANUBE試驗失敗）、肝細胞癌（III期HIMALAYA試驗進行中）等癌癥。AstraZeneca將Tremelimumab和一個anti-PD-1 mAb進行組合與改造，構建了MEDI5752。

CTLA-4在多種實體瘤TILs中的PD-1+ T細胞上表達富集

研究人員分析了來自4種腫瘤的44個腫瘤樣本：結直腸癌（CRC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、腎細胞癌（RCC）和黑色素瘤（Melanoma），發現在所有類型的腫瘤中均可發現PD-1+ CTLA-4+ 的CD4+ 和CD8+ T細胞，并且CTLA-4的表達在PD-1+ T細胞上富集。此外，研究人員還發現，腫瘤反應性CD8+ T細胞的標志物CD39在PD-1+ CTLA-4+ 腫瘤浸潤性淋巴細胞 (Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs)上表達富集。在隨后對183例頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN），NSCLC和尿路上皮細胞癌（UCC）樣本進行的影像融合（co-registration）分析顯示，80% SCCHN、84% 鱗狀細胞NSCLC（NSCLC-Sq）、89%腺癌NSCLC（NSCLC-Ad）和 90% 尿路上皮癌（UCC）中都存在PD-1+ CTLA-4+ TILs。

MEDI575的結構設計與特征

AstraZeneca將anti-CTLA-4的Tremelimumab和一個anti-PD-1 mAb進行組合，構成了MEDI5752的基本結構。MEDI5752中人gamma-1重鏈恒定區也進行了改造（L234F、L235E和P331S）以降低Fc介導的免疫效應功能。此外，與親本抗體一致，MEDI5752只對小鼠PD-1有低親和力，而和小鼠CTLA-4無交叉反應。

圖1. MEDI575的結構示意圖[1]

效價對PD-1的抑制作用影響很小，而對CTLA-4影響較大

研究人員使用了雙細胞熒光素酶報告實驗（two-cell luciferase reporter assay）和PBMC實驗來研究抗體效價（valence）對PD-1和CTLA-4抑制作用的影響。雙細胞熒光素酶報告實驗結果顯示，與二價anti-PD-1 mAb相比，單價anti-PD-1抗體MEDI5752或mvPD-1的半最大效應濃度（EC50）分別升高了3.5倍和3.8倍（圖2A-B）；與二價anti-CTLA-4 mAb相比，單價anti-CTLA-4抗體MEDI5752或mvCTLA-4的EC50則分別升高了14.9倍and 13.3倍（圖2C-D）。

在PBMC實驗中，研究人員也觀察到了類似的現象。mvPD-1誘導PBMC增加2倍IL2分泌量的最低有效濃度（MEC）只比anti-PD-1 mAb高1.14倍；而mvCTLA-4的MEC則比anti-CTLA-4 mAb高8.1倍。這些結果說明valence對PD-1的抑制作用影響很小，而對CTLA-4的抑制作用影響較大，因此，MEDI5752與CTLA-4的結合能力在PD-1− T細胞上可能會顯著下降。

圖2. 單價（Monovalent）降低了MEDI5752對CTLA-4的效力，但對PD-1的抑制作用影響很小[1]

MEDI5752能優先抑制PD-1+ 細胞上的CTLA-4

在靶向兩個不同的細胞表面受體的雙抗中，雙抗會傾向優先與表達密度高的受體結合。因此，雙抗與表達密度高的受體的結合率將只取決于對應單價臂對該受體的內在親和力，而第二個單價臂與表達密度低的受體的結合則會被限制在一個相當于抗體長度的半徑范圍中。在這個范圍里，第二個單價臂對表達密度低的受體的結合力明顯增強，研究人員將這個現象稱為“cooperative binding”（圖3A）。已知在PD-1+ CTLA-4+ 雙陽性T細胞中，PD-1在細胞膜上的表達密度比CTLA-4高，因此，MEDI5752會優先與PD-1結合。并且，與只表達CTLA-4的PD-1- CTLA-4+ CHO細胞相比，MEDI5752會優先靶向和飽和PD-1+ CTLA-4+ CHO細胞上的CTLA-4（圖3B）。

為了探究“cooperative binding”的效應，研究人員在活化的人PBMC中加入（block）或不加入（no block）飽和濃度的PD-1抗體進行處理。在block組，MEDI5752只會與CTLA4結合；在no block組，MEDI5752能發揮“cooperative binding”效應。實驗結果顯示，“cooperative binding”效應顯著降低了誘導PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI5752濃度（93.55倍） (圖3C)。這些結果說明MEDI5752 能優先抑制PD-1+細胞上的CTLA-4。

圖3. 與PD-1- CTLA-4+ 單陽性細胞相比，MEDI575優先與PD-1+ CTLA-4+ 雙陽性細胞上的CTLA-4結合[1]

MEDI5752介導了PD-1的內化和降解

有報道顯示，細胞膜表面80%的CTLA-4會在5分鐘內被快速內化（internalization），因此在任意時間點，細胞膜表面都只會有少量的CTLA-4存在。研究人員探究了MEDI575及其親本抗體在PD-1+ CTLA-4+ CHO細胞、人原代CD4+ 和CD8+ T細胞中的內化能力。結果顯示MEDI5752和只靶向CTLA-4的抗體（anti-CTLA4 mAb和mvCTLA4）都能被快速內化，而只靶向PD-1的抗體（anti-PD-1 mAb和mvPD-1）的內化程度非常低（圖4A）。

為探究內化后PD-1和CTLA4的去向，研究人員使用了帶有熒光標記的PD-1+ SNAP-tag/CTLA4+ CLIP-tag雙陽性CHO細胞來進行追蹤。實驗結果顯示，只有同時靶向PD-1和CTLA-4的MEDI575能顯著增強對細胞膜表面PD-1的降解；此外，與加入Buffer的空白對照組對比，加入靶向PD-1或CTLA-4抗體并沒有顯著改變CTLA4的內化（圖4B）。這些結果說明MEDI5752通過與CTLA-4結合，介導了PD-1的內化和降解。

圖4. MEDI575介導了PD-1的內化和降解[1]

與單抗組合相比，MEDI5752優先靶向雙陽性細胞上的CTLA-4

與單抗組合（anti-CTLA4 mAb和anti–PD-1 mAb）相比，MEDI5752能以低10倍和250倍的濃度分別使PD-1+ CTLA-4+（10:1）CHO細胞和PD-1+ CTLA-4+（40:1）CHO細胞上的CTLA-4飽和（圖5A-B）。此外，MEDI5752飽和PD-1的能力與單抗組合相比沒有明顯區別（圖5B）。接下來，研究人員再次在活化PBMC上探究了MEDI5752 的“cooperative binding”效應。實驗結果顯示，與單抗組合（anti-PD-1 mAb/anti-CTLA4 mAb 或anti-PD-1 mAb/mvCTLA4 mAb）相比，MEDI5752 的“cooperative binding”效應顯著降低了誘導PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI5752濃度（42.33倍和96.35倍）（圖5C-D）。這些結果說明與單抗組合相比，MEDI5752有更強的功效。

由于CTLA-4能通過在Treg上的表達來內在地和外在地調節T細胞活化，研究人員將原代Treg與同種異體（allogeneic）的CD3+ T細胞，以及清除了CD3+ 細胞的PBMC共培養，來模擬相關共刺激分子存在時，淋巴細胞的免疫反應。實驗結果顯示，單抗組合能克服Treg介導的對Teff的抑制作用，且與單抗組合相比，在Treg:Teff比例為1:4和1:8時，MEDI5752能使IFNγ的分泌量顯著增加（圖5E-G）。這些結果說明與單抗組合相比，MEDI5752在T細胞活化和克服Treg介導的抑制作用時有更高的活性。

圖5. 與單抗組合相比，MEDI5752優先靶向雙陽性細胞上的CTLA-4[1]

MEDI5752在體內能優先定位于腫瘤部位并抑制腫瘤生長

由于MEDI5752與小鼠PD-1和CTLA-4缺乏交叉反應，研究人員使用了一款表達人PD-1和CTLA-4蛋白（C57BL/6N-Pdcd1tm1(huPDCD1-ICP11)GenoCtla4tm1(huCTLA4-ICP13)Geno）的轉基因小鼠來進行體內實驗。賽業已引進該PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點人源化小鼠。實驗結果顯示，在攜帶小鼠纖維肉瘤MCA205的hPD-1/hCTLA-4小鼠中，與傳統的anti-CTLA4和isotype mAb相比，MEDI5752顯著聚積在腫瘤部位；MEDI5752與傳統的anti-PD-1 mAb在腫瘤部位的聚積程度相似（圖6A-D）。這些結果說明MEDI5752在腫瘤部位的聚積依賴于與腫瘤表面PD-1的結合。同時，這也說明對比anti-CTLA4 mAb，MEDI5752能更有效地阻斷腫瘤微環境中的CTLA-4。

在MCA205荷瘤模型中，MEDI5752也顯示出了強烈的，劑量依賴性的抗腫瘤活性：當注射劑量為10 mg/kg時，MCA205在超過60%的小鼠中完全清除了腫瘤（圖6E）。此外，與anti-PD-1和anti-CTLA4 mAb對比，單抗組合并沒有顯著提高荷瘤小鼠生存率，而MEDI5752功效顯著（圖6F）。而且，將人類病毒特異性T細胞注射到攜帶人病毒肽轉導的OE21腫瘤的NSG小鼠中后，MEDI5752顯著抑制了腫瘤生長（圖6G）。這些結果說明與anti-CTLA4 mAb相比，MEDI5752在體內能優先定位于腫瘤部位;而與單抗組合相比，MEDI5752有更強的抗腫瘤活性。

圖6. MEDI5752在體內能優先定位于腫瘤部位并抑制腫瘤生長[1]

MEDI5752在晚期實體瘤中被證明有抗腫瘤活性

目前，MEDI5752正在進行一項針對晚期實體瘤的評估(NCT03530397)，這也是MEDI5752在人體內的首次試驗。MEDI5752在兩名患者體內實現了部分緩解。其中，一名已經歷五次化療失敗的61歲胃腺癌患者的腫瘤縮小了60％（圖7A）；另一名從未經過治療的51歲腎透明細胞癌患者的腫瘤縮小了68％（圖7B）。目前，兩名患者的無進展（progression-free）生存期已分別有80周和24周，且毒性可控。

圖7. MEDI5752在晚期實體瘤中有抗腫瘤活性[1]

總結

AstraZeneca這款同時靶向PD-1和CTLA-4的單價雙抗MEDI5752在體外和體內實驗中均顯示出了顯著的抗腫瘤活性。MEDI5752利用“cooperative binding”，在靶向PD-1+ T細胞的同時，提高了anti-CTLA-4單臂對CTLA-4的結合力，且能優先抑制PD-1+細胞上的CTLA-4。此外，MEDI5752融合了anti-CTLA-4和anti-PD-1的優勢，能引發對PD-1的快速內化，并能優先定位在腫瘤部位。這些都顯示出了PD-1/CTLA-4雙抗的獨特優勢。

目前，多家公司在PD-1/CTLA-4雙抗上也均有布局，產品包括中山康方（ Akesobio ）已進入phase Ib/II 的AK104、康寧杰瑞（Alphamab）已進入phase II的KN046、齊魯制藥（Qilu Pharmaceutical）已進入phase I的QL1706等。

賽業生物模式動物創新藥物研發平臺還可以根據您的需求提供各種有效的腫瘤研究模型，如傳統免疫缺陷鼠裸鼠、NOD scid、重度免疫缺陷鼠C-NKG和BRGSF、免疫檢查點人源化小鼠、腫瘤細胞系移植模型、人源腫瘤組織異種移植模型（CDX）、基因修飾模型及表型分析服務等。我們可以構建各類皮下、原位或者轉移瘤模型，并針對相應的模型提供高度定制化的體內藥效學服務，以滿足您的需求。如有需要，歡迎聯系我們~

PD-1/CTLA-4雙人源化小鼠助力腫瘤研究

品系背景： C57BL/6N

品系構建策略：

PD-1/CTLA-4雙免疫檢查點人源化小鼠模型（hPD-1/hCTLA-4）由hPD-1小鼠和hCTLA-4小鼠雜交得到。

品系說明：

■ hPD-1和hCTLA-4在小鼠體內具有正常的生理表達和調節模式。

■ PD1和CTLA-4胞外域人源化，利于hPD-1和hCTLA-4靶向藥物的識別。

■ 保留小鼠PD-1和CTLA-4胞內域，保證正常的胞內信號轉導。

■ 小鼠靶基因不表達，避免交叉反應。

小鼠的免疫系統功能健全。

研究應用：

本模型可用于評估hPD-1和/或hCTLA-4靶向藥物在免疫健全小鼠體內的藥效及安全性：

可以與人源腫瘤細胞系 MC38-hPD-L1聯用，構建同源腫瘤模型，以測試靶向人PD-1和人PD-L1的聯合療法的療效。

模型驗證：

PD-1和CTLA-4表達檢測

圖1. hPD-1和hCTLA-4在hPD-1/hCTLA-4小鼠中的表達模式與mPD-1和mCTLA-4在野生型小鼠中的表達模式一致。

用αCD3/αCD29抗體激活從野生型小鼠和hPD-1/hCTLA-4小鼠中分離的脾細胞。在hPD-1/hCTLA-4小鼠中，傳統CD4+ T細胞表達hPD-1和hCTLA-4；在野生型小鼠中，傳統CD4+ T細胞表達mPD-1和mCTLA-4。

圖2. hPD-1和hCTLA-4在腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）中的表達情況。

在hPD-1/hCTLA-4小鼠和野生型小鼠體內接種MCA205小鼠纖維肉瘤細胞，并分析TILs上鼠源和人源PD-1以及CTLA-4在的表達情況。