疾病動物模型是研究人類疾病發生發展機制、藥物篩選及療效評價必不可少的工具，好的疾病動物模型可以加快新藥的研發速度。你還在為不知道選擇什么小鼠模型發愁嗎？你還在為造模發愁嗎？賽業生物新欄目《每周一鼠》，每周更新，為大家講解一個疾病小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的疾病小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是無菌鼠。

隨著基因組學、代謝組學等高通量檢測技術的應用，人們逐漸認識到胃腸道微生物群存在巨大遺傳多樣性和代謝復雜性。這些共生細菌通過與宿主的復雜交互作用調節胃腸道的發育和功能，與營養代謝、腫瘤、免疫、衰老等多種生理或病理狀態密切相關。在人體微生物組學中，96-99%的微生物聚集在胃腸道，同時也是研究領域的重點方向，并且從2011年開始，微生物研究成果屢上十大科學突破榜。但由于體內微生物群體組成和作用的網絡十分復雜，且每一個自然個體體內的微生物組成都不完全相同，使得其研究十分困難。因此需要一種理想的模型來探索微生物與宿主的作用及相關機制，而無菌動物就是理想的模型。

無菌動物的發展史

1885年，路易斯·巴斯德即提出生命依賴于微生物的定殖，并嘗試研究宿主與微生物的相互作用。為測試動物宿主能否在無菌（germfree, GF）狀態下生存，Nuttal和Thierfelder首次在無菌條件下飼養豚鼠。這種無菌豚鼠外觀健康，并于第8天處死，其腸內容物沒有檢出細菌。同時此次試驗也觀察到了一些顯著的表型差異，例如盲腸增大（常規體積的五倍）。其盲腸中充滿了“一種含奶酪塊樣物質的棕色液體”。研究表明這些盲腸內容物中含有毒性生物活性物質，可導致平滑肌收縮能力的改變。這種無菌動物模型在生理和生化方面也表現出一定的異常表型，如免疫系統功能改變，輕度慢性腹瀉，代謝紊亂，生殖能力降低等[1]。

圖1. 12周齡的無菌Swiss Webster雌鼠和常規飼養小鼠的腹腔臟器比較（*表示盲腸）

20世紀中期前，受技術限制，飼養健康的無菌動物一直是一項挑戰。20世紀40年代中期至50年代初，Reyniers等創造了不銹鋼制的無菌動物大型隔離器，使無菌動物的研究逐漸系統化。20世紀50年代末，研究人員已掌握無菌類動物模型的飼養技術，成功飼養無菌豚鼠、小鼠和雞。此后研究人員開始將無菌動物與傳統飼養的動物進行比較研究，通過一次引入一種或幾種微生物菌種，探究宿主與微生物的相互作用[2]。借助這些無菌動物模型，科學家們逐漸揭示了微生物-微生物相互作用、基因-微生物相互作用、飲食-微生物相互作用以及影響胃腸道微生物定殖的因素等。

無菌動物（小鼠）基本概念

無菌動物指現有檢測方法不能檢出任何活的微生物和寄生蟲的動物。“無菌”不是絕對的，只是依據現有技術尚無法檢出已知的微生物和寄生蟲。即使是SPF級動物也難以排除自身攜帶潛在致病菌的可能，其體內存在特異性抗體等免疫激活狀態，會對后續實驗研究產生潛在干擾，甚至影響實驗結果的判讀。無菌動物必須是采用特殊技術保證動物從出生后即無菌，需要在隔離系統繁育飼養，即在無菌條件下經人工剖宮產獲得子代動物，再放入無菌隔離系統內經人工喂乳或無菌母體動物代乳喂養。在飼養繁育過程中，使用的飼料、飲水需經過嚴格消毒，并通過定期檢測手段確保動物體內外無一切微生物和寄生蟲。

無菌小鼠是目前研究宿主-微生物相互作用的重要動物模型，主要原因有三。首先，實驗小鼠的基因型已得到很好的表征。其次，小鼠和人類基因組在功能上99%相似度。第三，轉基因小鼠不同于其他實驗動物，它允許我們引入精確的基因修飾（如基因插入、敲除和修飾），允許我們在活體狀態下研究修飾基因的功能。將轉基因小鼠凈化繁育為無菌模型后，可進一步了解環境和宿主基因對微生物群落的影響，以及微生物群落對宿主基因表達、表觀遺傳變化和宿主生理學的影響，作為構建微生物靶向療法的臨床前模型。

無菌動物的特征

無菌動物由于飼養方法特殊，其結構、功能與普通動物有很大區別，表現為：腸道肌層變薄、盲腸顯著肥大、腸粘膜絨毛增多、肝重量下降；血液系統中白細胞增加且數值恒定；單核-吞噬細胞功能降低，脾縮小，無三級濾泡；淋巴組織發育不良，產生抗體的能力很弱，對微生物感染異常敏感；腸上皮細胞更新率低，腸壁物質交換較慢。

無菌飼育設施

無菌飼育設施在空間布局和人員安排方面需要專業基礎設施，包括但不限于適當的聲屏障、應急電源和中心警報、高效過濾器進氣口和正壓空間。在上述場地條件下，小鼠飼養于可調節的隔離裝置中，其溫度、濕度、壓力、氣流等因素能得到精確控制[3]。食物、水和其他用品必須用高壓滅菌裝置、輻照或消毒劑充分消毒，以滅活所有活微生物和寄生蟲，飼料中還需補充腸道細菌合成的營養成分。隨后將裝載上述物品的高壓滅菌桶經轉移套筒送入隔離飼養室，轉移套筒傳送前須消毒滅菌。也可將其他方式滅菌的物品置于傳遞倉處，在送入隔離裝置前進行消毒。類似方法也可用于隔離飼養室內物品和樣本的取出。

圖2. 無菌小鼠的食物（上）、墊料（中）和飲水（下）依次通過封裝、貼消毒指示標簽、進入消毒桶消毒后才可進入隔離室

根據不同使用目的，無菌小鼠可飼養在不同型號隔離器內。一般大型隔離器可用于種群繁育或實驗組只數較多的實驗用途，較小的隔離器（容納4-5個籠子）中主要用于一般規模實驗或重要品系保種。后者多數情況下可飼養一組的小鼠實驗需求只數，相較前者，在有限空間內可開展更多的實驗。場地內應配專業技術人員，負責飼養設施的日常工作、定期維護和小鼠的繁育管理或實驗操作。

圖3. 無菌鼠飼養設備。A）用于飼養無菌小鼠的隔離裝置；B）滅菌桶

凈化繁育

無菌動物在自然界中并不存在，只能依靠人工養育。一般將臨產前的健康動物用麻醉藥物或拉斷頸椎處死后，立即浸泡于37℃滅菌液中浸泡，隨后送進無菌室（或無菌隔離器），通過無菌手術剖腹取出無菌狀態的帶胎子宮。將子宮浸入消毒液后再立即輸送至另一只隔離器中，切開子宮取胎。幼崽經滅菌紗布擦拭并斷臍后放入隔離器內人工喂乳或由其他無菌雌鼠代養。

無菌狀態的監測

為確保無菌動物的無菌狀態，必須定期對小鼠生活標本和糞便標本進行監測。檢測方法包括培養法、革蘭氏染色和16srRNA檢測。此外，可送檢隔離包內活體小鼠進行監測。

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參考文獻：

1. Mazmanian SK, Liu CH, Tzianabos AO, Kasper DL. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 2005;122(1):107-118.

2. Williams SC. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014;111(5):1661.

3. Arvidsson C, Hallén A, Bäckhed F. Generating and Analyzing Germ-Free Mice. Current protocols in mouse biology. 2012;2(4):307-316.

4. Fontaine CA, Skorupski AM, Vowles CJ, Anderson NE, Poe SA, Eaton KA. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 2015;6(4):225-233.