內質網對各種應激刺激具有獨特的感知和反應能力。內質網應激反應可由過量或錯誤折疊的蛋白質積累、葡萄糖缺乏等細胞功能失衡引起。其通過三種主要機制來恢復體內平衡，統稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）[1]。肌醇需求酶1α（IRE1α）介導的X盒結合蛋白1（XBP1）可變剪接是內質網UPR的主要效應通路之一，功能上也最為保守[2]。IRE1是一種內質網駐留跨膜核酸內切酶/激酶，其位于內質網腔的氨基末端區負責感受各種內質網應激刺激。受到刺激后，IRE1α二聚化并發生構象改變，自身磷酸化并激活核酸內切酶活性[3]。

XBP1 mRNA是哺乳動物IRE1目前已知唯一的酶切底物。正常情況下，XBP1 mRNA可翻譯產生一個261個氨基酸的非剪接型蛋白（XBP1 unsplicing isoform, XBP1u）。其具有一個N末端二聚體結構域、內部的堿性亮氨酸拉鏈結構域（bZIP）以及含有兩個疏水區、核輸出信號和蛋白酶體結合位點的C末端[4]。受到刺激后，XBP1u的翻譯暫停，新轉錄的XBP1u mRNA在細胞質Sec61轉運子輔助下，借助其HR2結構域與內質網結合。在激活的IRE1α和連接酶RtcB作用下，其中的26個核苷酸被去除，產生開放閱讀框移位，最終產生一個376氨基酸的剪接后蛋白（XBP1 splicing isoform, XBP1s）[4]。XBP1s保留了N末端的二聚體結構域和內部bZIP結構域，C端出現反式激活結構域，形成一個完整的轉錄因子，負責應激反應后的轉錄調控。

圖1. XBP1非常規剪接示意圖

氧化應激損傷是多種心血管疾病發病的使動因素，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌缺血再灌注損傷、高血壓性心臟病，亦屬于內質網應激反應的一種。前期研究表明XBP1可變剪接參與了多種血管生理和病理過程，比如血管內皮細胞生長因子（VEGF）介導內皮細胞增殖（血管新生）[5]、血小板源生長因子（PDGF）介導平滑肌細胞增殖（新生內膜形成）[6]、紊流刺激下的內皮細胞凋亡（動脈粥樣硬化）[7]等。感興趣的小伙伴可查看以上相關研究論文進行學習。本期我們介紹今年3月份發表于J Biol. Chem.的一篇論文[8]。作者在探究血管損傷后新生內膜形成的機制中發現了一種由血管平滑肌細胞表達的Ⅳ型膠原新異構體（COL4A1s）。該蛋白通過旁分泌機制招募駐留于外膜的血管祖細胞，促進其遷移并最終促進損傷處的新生內膜形成。下面讓我們解讀一下文章的幾張重要Figure，探討XBP1條件敲除小鼠在整個實驗設計中的作用。

XBP1在胚胎發育和血管重塑過程中對COL4A1的表達至關重要

該課題組以往的研究表明XBP1的剪接參與了血管損傷后血管平滑肌細胞發生增殖表型轉化（PMID: 26315405）；來自過表達XBP1s的血管平滑肌細胞，其培養液上清能促進小鼠血管祖細胞（VPC）遷移（原文Figure 6）。為驗證XBP1、COL4A1和血管祖細胞遷移之間是否存在相關性，作者檢測了血管平滑肌細胞條件敲除XBP1小鼠中COL4A1的表達和血管祖細胞遷移。結果表明導絲損傷血管內膜后，野生型小鼠組α-平滑肌肌動蛋白（αSMA）和干細胞抗原1陽性（Sca1+）細胞被招募到新生內膜區域。而血管平滑肌細胞條件敲除XBP1后上述細胞的募集和內膜生成受到顯著抑制。值得注意的是，血管平滑肌細胞XBP1的敲除還顯著降低了血管壁COL4A1的表達水平。由于XBP1全敲小鼠具有胚胎致死性，研究人員對Xbp1+/- X Xbp1+/-胚胎中COL4A1表達水平進行了檢測，發現Xbp1基因缺失導致COL4A1以基因依賴的方式降低表達。

圖2. XBP1s對COL4A1在胚胎發育和血管重塑過程中的表達至關重要

過表達XBP1s誘導COL4A1新型異構體的表達

COL4A1和COL4A2共用一段啟動子。RT-PCR表明過表達XBP1s可上調COL4A1和COL4A2 mRNA水平。過表達XBP1s后，在血管平滑肌細胞培養上清中檢測到分子量更小（50kDa條帶）的COL4A1條帶，提示COL4A1可能發生了降解。酶譜分析表明過表達XBP1s確實增加了一些蛋白酶的分泌。但酶抑制劑并不能消除XBP1s誘導出的50kDa COL4A1條帶，提示其并非蛋白酶降解而來。

圖3. XBP1剪接異構體（XBP1s）誘導出一種新的COL4A1s異構體

有文獻報道COL4A1的非膠原（non-collagen, NC）結構域可被蛋白酶降解，并影響血管祖細胞的遷移，但NC結構域分子量通常小于40kDa。該50kDa蛋白條帶很可能為COL4A1的一種新異構體。為驗證這一點，作者設計了一對全長引物行常規RT-PCR，并擴增出一條1.6kb條帶（預期為5kb）。克隆測序結果表明該PCR產物為一種新的轉錄變體，其第4外顯子的后部和第42外顯子的前部間發生拼接，開放閱讀框保持不變。這種新轉錄變體可翻譯553個氨基酸的蛋白并外泌，故命名為COL4A1s（soluble COL4A1s），其中信號肽、7S結構域和NC結構域均得以保留，而內部螺旋結構域長度大大縮短。隨后，作者進一步提出了COL4A1s發生的兩種可能機制，即mRNA水平的非常規剪接和基因水平的繞行轉錄，并通過體外轉錄、ChIP、DNA-蛋白拉下實驗等進行了驗證，感興趣的小伙伴可以查閱原文的Figure 5。

圖4. XBP1s誘導表達一種可外泌COL4A1s新異構體

小結

在這項研究中，明確血管平滑肌細胞XBP1s對COL4A1s的上游調控作用是后續開展機制研究的先決條件。為此作者構建了血管平滑肌細胞條件敲除XBP1的轉基因小鼠，并在此基礎上構建了股動脈導絲拉傷模型，通過免疫組化、免疫熒光等實驗技術闡釋了血管損傷對XBP1s、COL4A1及血管壁細胞組成的直觀認識。考慮到XBP1全敲小鼠存在胚胎致死的特點，研究者將XBP1+/-小鼠交配產生的不同基因型胚胎作為另一種驗證方式。最終，從在體水平證實了XBP1為COL4A1上游調控基因的研究線索，為后續深入開展XBP1s-COL4A1s信號通路調控血管損傷后新生內膜形成的機制研究奠定了基礎。

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原文檢索：

1. Ren J, Bi Y, Sowers JR, Hetz C, Zhang Y. Endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response in cardiovascular diseases. Nature reviews Cardiology. 2021.

2. Sriburi R, Jackowski S, Mori K, Brewer JW. XBP1: a link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. The Journal of cell biology. 2004;167(1):35-41.

3. Ali MM, Bagratuni T, Davenport EL, Nowak PR, Silva-Santisteban MC, Hardcastle A, et al. Structure of the Ire1 autophosphorylation complex and implications for the unfolded protein response. The EMBO journal. 2011;30(5):894-905.

4. Yanagitani K, Kimata Y, Kadokura H, Kohno K. Translational pausing ensures membrane targeting and cytoplasmic splicing of XBP1u mRNA. Science (New York, NY). 2011;331(6017):586-589.

5. Zeng L, Xiao Q, Chen M, Margariti A, Martin D, Ivetic A, et al. Vascular endothelial cell growth-activated XBP1 splicing in endothelial cells is crucial for angiogenesis. Circulation. 2013;127(16):1712-1722.

6. Zeng L, Li Y, Yang J, Wang G, Margariti A, Xiao Q, et al. XBP 1-Deficiency Abrogates Neointimal Lesion of Injured Vessels Via Cross Talk With the PDGF Signaling. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2015;35(10):2134-2144.

7. Zeng L, Zampetaki A, Margariti A, Pepe AE, Alam S, Martin D, et al. Sustained activation of XBP1 splicing leads to endothelial apoptosis and atherosclerosis development in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009;106(20):8326-8331.

8. Angbohang A, Huang L, Li Y, Zhao Y, Gong Y, Fu Y, et al. X-box binding protein 1-mediated COL4A1s secretion regulates communication between vascular smooth muscle and stem/progenitor cells. The Journal of biological chemistry. 2021:100541.