想調整研究方向，獲得學術研究突破口？想獲得論文選題思路，提高發文命中率？你需要了解學科發展態勢和未來走向！賽業生物專欄《Gene of the Week》每周會根據熱點研究領域介紹一個基因，詳細為您介紹基因基本信息、研究概況和應用背景等，助您保持學術研究敏銳度，提高科學研究效率，期待您的持續關注哦。今天我們要講的主角是Alport綜合癥致病基因之一COL4A5。

基因基本信息

COL4A5基因研究概況

COL4A5是編碼IV型膠原蛋白的六個基因之一，這種蛋白膠原肽是細胞膜的重要基質之一。該基因位于X染色體上，長度超過20萬個堿基對，屬于相對較大的基因。同時，其外顯子超過50個。該基因的突變有可能導致眼-耳-腎綜合癥，該疾病又被稱為Alport綜合癥。

該疾病是一種遺傳性膠原病，由于該基因位于X染色體上，因此遺傳與性別有關。3種編碼IV型膠原蛋白的基因發生改變都有可能造成該疾病的發生，它們分別是編碼α3、α4和α5鏈的COL4A3、COL4A4和COL4A5。這些蛋白的突變會導致基底膜發生病變，其中腎臟受損最為明顯，表現為尿血、蛋白尿和腎功能進行性下降；其次常伴有神經性聽力下降和視覺異常，這是由于患者不同氣管膠原結構異常所導致。這三種基因共同在人群中有1/10 000～1/5000的致病突變攜帶率。

圖1. Alport綜合癥，信息來源：https://kidneyfailuretreatment.in/alport-syndrome/.

雖然COL4A3和COL4A4都會引起Aloport綜合癥，但是，由這兩個基因突變引起的Aloport綜合癥比例只有20%，大部分Alport綜合癥都是由于COL4A5基因突變造成的。其中，涉及到外顯子的突變中有接近一半是錯義突變，另外有1/4是移碼突變，此外還有少量的無義突變和剪切位點突變，其中無義突變和移碼突變引起的病情最重，發病也一般較早。通過對該基因外顯子突變與臨床信息的關聯來看，該基因外顯子發生突變會有超過70%的致病概率，如果把一些大概率致病的突變也加入進來，則突變致病的概率為84%。

圖2. COL4A5與Alport綜合癥。信息來源：Clinvar.

2019年，日本實驗室構建了最新的Alport疾病模型，用同源重組的方法將含有人類相應突變（R471X）附近的序列通過sgRNA引導，Cas9切割，ssODN（含突變位點）進行修復等一系列的過程構建了無義突變的小鼠。造成該蛋白無法表達。對尿液的檢測發現R471X小鼠的蛋白和肌酐水平顯著高于正常組；血液中總蛋白沒有顯著差異，但是血液中的尿氮和尿肌酐出現明顯的提升。對6周大的小鼠進行免疫組實驗化也發現了R471X小鼠的腎小管纖維化。

圖3. COL4A5敲除小鼠的構建。引自：Hashikami et al. 2019。

圖4. COL4A5敲除小鼠模型的表型。引自：Hashikami et al. 2019.

第二年，同一個實驗室利用反義寡核苷酸（antisense-oligonucleotide, ASO）對上述模型（R471X）進行了治療，原理是通過阻止21號外顯子的翻譯，讓20號和22號外顯子直接相連，跳過無義突變的區域。從小鼠4周齡開始，4-6周每周兩次皮下注射，7-20周每周注射一次。結果顯示經過ASO治療的小鼠的生存狀態大大好于R471X小鼠，完全達到了野生型的水平。在體重沒有明顯區別的情況下，其尿蛋白/尿肌酐水平大大降低，同時血液中的各項指標也幾乎恢復到了野生型小鼠的水平。

圖5. 外顯子跳躍示意圖。引自：Yamamura et al. 2020.

圖6. 經過ASO治療的小鼠的生存狀態大大好于R471X小鼠，完全達到了野生型的水平。引自：Yamamura et al. 2020.

圖7. 經過ASO治療的小鼠和R471X小鼠表型指標。引自：Yamamura et al. 2020.

COL4A5作為X染色體連鎖Alport綜合癥的主要致病基因，一方面需要加強大眾對該疾病的認識，有相關癥狀的父母需要進行診斷及家族病史追蹤，確認是否為該疾病的攜帶者；另一方面也需要基因測序的成本繼續降低，才能讓更多的人從源頭上避免該類疾病的發生；此外，即便確診了疾病，目前基因治療技術的發展也讓我們不再對Alport綜合癥完全束手無策，至少看到了值得為之努力的方向。

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在過去的幾十年里，基因治療在治療遺傳性疾病方面取得了重大進展。以基因組學或蛋白組學的方式找到致病基因，再結合細胞水平或動物水平驗證，用這種模式產出的高質量文章層出不窮。

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推薦文獻：

1. Hashikami K, Asahina M, Nozu K, Iijima K, Nagata M, Takeyama M. Establishment of X-linked Alport syndrome model mice with a Col4a5 R471X mutation. Biochem Biophys Rep. 2018;17:81-86. Published 2018 Dec 12. doi:10.1016/j.bbrep.2018.12.003

2. Yamamura T, Horinouchi T, Adachi T, Terakawa M, Takaoka Y, Omachi K, Takasato M, Takaishi K, Shoji T, Onishi Y, Kanazawa Y, Koizumi M, Tomono Y, Sugano A, Shono A, Minamikawa S, Nagano C, Sakakibara N, Ishiko S, Aoto Y, Kamura M, Harita Y, Miura K, Kanda S, Morisada N, Rossanti R, Ye MJ, Nozu Y, Matsuo M, Kai H, Iijima K, Nozu K. Development of an exon skipping therapy for X-linked Alport syndrome with truncating variants in COL4A5. Nat Commun. 2020 Jun 2;11(1):2777. doi: 10.1038/s41467-020-16605-x. PMID: 32488001; PMCID: PMC7265383.

3. Nozu K, Takaoka Y, Kai H, Takasato M, Yabuuchi K, Yamamura T, Horinouchi T, Sakakibara N, Ninchoji T, Nagano C, Iijima K. Genetic background, recent advances in molecular biology, and development of novel therapy in Alport syndrome. Kidney Res Clin Pract. 2020 Dec 31;39(4):402-413. doi: 10.23876/j.krcp.20.111. PMID: 33214343; PMCID: PMC7771000.