2021年3月25日，百時美施貴寶（Bristol Myers Squibb，BMS）公司宣布其抗LAG-3單抗relatlimab聯(lián)合抗PD-1單抗Opdivo（nivolumab）的組合療法，在評估未經治療的轉移性或不可切除性黑色素瘤患者的II/III期臨床試驗RELATIVITY-047（CA224-047）中，相比 Opdivo單獨用藥可顯著改善患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS），試驗達到主要終點。這是全球首個抗LAG-3抗體的臨床III期數(shù)據(jù)。

該試驗采用了隨機、雙盲設計：一共714位患者以1:1的比例隨機分配，分別接受160 mg relatlimab和480 mg Opdivo組合藥物，或480 mg Opdivo單獨用藥。每四周一次靜脈注射給藥。這次試驗的次要終點——總生存期(overall survival，OS）和客觀應答率（objective response rate，ORR）還未達到，試驗還在進行中。在安全性方面，目前固定劑量的聯(lián)合療法耐受性良好，兩個給藥組中都未出現(xiàn)新的安全信號。

1 LAG-3簡介

淋巴細胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3，LAG-3），又稱為CD233，由 Triebel及其同事于1990年發(fā)現(xiàn)。LAG-3是一個Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白（Ig）超家族，主要表達在活化T細胞和NK細胞表面。

LAG-3是T細胞的一個抑制性免疫檢查點。與PD-1和CTLA-4一樣，LAG-3能負向調控T細胞的增殖、激活和穩(wěn)態(tài)。在人CD4+細胞中封閉LAG-3能促進細胞增殖，并提高 IL-2、IL-4、IFN-γ和TNFα的表達水平。此外，有研究認為LAG-3參與了調節(jié)性T細胞（Treg）的抑制性作用[1]。當處于腫瘤環(huán)境或慢性感染時，長期的抗原刺激會導致LAG-3持續(xù)高表達，引起T細胞耗竭（exhaustion）。因此，阻斷LAG-3信號通路能促進耗竭T細胞恢復功能。

此外，與CTLA-4和CD28不一樣，研究表明LAG-3可能不是通過與CD4競爭配體MHC II來調控T細胞活性，而是通過其胞內結構域直接向T細胞轉導抑制性信號[4]。

2 LAG-3結構

人體中，LAG3基因在第12號染色體上（12p13），與CD4（12p13.31）相近。此外，雖然LAG-3和CD4在蛋白質水平上只有約20%的同源性，它們在蛋白結構上同源性很高。與CD4一樣，LAG-3的胞外區(qū)也含有4個Ig樣結構域（D1-D4），且都在D1和D2之間、D3和D4之間顯示出了剛性（rigidity），而在D1-D2和D3-D4之間顯示出了相對的靈活性（flexibility）。

LAG-3的胞質尾由三個部分組成：一個絲氨酸磷酸化位點、一個“KIEELE”模體（motif），和一個谷氨酸脯-氨酸二肽重復序列（EP repeat）。其中，“KIEELE”模體高度保守，并可能參與了LAG-3下游抑制信號的轉導，因為缺乏該結構的LAG-3蛋白不能發(fā)揮對T細胞的抑制作用[2]。

此外，LAG-3還存在可溶性形式（sLAG-3）。sLAG-3可由可變剪接產生，也可由膜結合LAG-3經蛋白質水解切割產生。與膜結合LAG-3一樣，sLAG-3可以與MHC II結合，但有研究顯示其只會與一小部分抗原呈遞細胞（APC）上的脂筏微結構域（lipid raft microdomain）上的MHC II結合[3]。目前關于sLAG-3的具體作用功能還不明確，有研究表明其與樹突狀細胞（DC）上的MHC II結合能促進DC的成熟和活化。

圖1. LAG-3和sLAG-3的結構示意圖[4]

3 LAG-3的配體

與CD4一樣，LAG-3能與主要組織相容性復合體II類分子（major histocompatibility complex II，MHC II）結合。但相較CD4，LAG-3與MHC II的親和力更高（約100倍），因為LAG-3可以通過其D1域中一個由30個氨基酸組成的環(huán)狀結構，增強與MHC II的互相作用[4、5]。研究表明，LAG-3能選擇性地與穩(wěn)定的抗原肽-MHC II分子復合物（pMHC II）結合，因此，LAG-3能優(yōu)先抑制穩(wěn)定的pMHCII的CD4+T細胞的活化[8]。此外，MHC II主要表達在APC上，但包括黑色素瘤在內的多種腫瘤細胞也會高表達MHC II，并且這種異常表達與不良預后相關。

另外，有研究表明FGL1（fibrinogen-like protein1）也是LAG-3的主要配體之一[6]。FGL1屬于纖維蛋白原蛋白質家族，由肝細胞產生分泌，在多種腫瘤細胞上均有高表達，例如前列腺癌和黑素瘤。

LAG-3還有兩個可能的配體LSECtin和Galectin-3，它們可以與LAG-3上的聚糖相互作用。LSECtin屬于C-型凝集素，主要在肝臟表達，此外，多種腫瘤細胞會高表達LSECtin，包括黑色素瘤、膀胱癌和胰腺癌。Galectin-3是半乳糖苷粘連蛋白，在多種細胞及惡性腫瘤細胞中均有表達，包括腫瘤微環(huán)境中的基質細胞和CD8+ T細胞。

圖2. LAG-3的結構及配體[7]

4 總結與展望

LAG-3是一個非常有應用前景的免疫治療靶點。正如Jonathan Cheng，BMS的高級副總裁所說，“免疫檢查點抑制劑的單用或組合用藥已經改變（腫瘤）治療方法，但仍然有相當多的患者可以從利用互補通路來提高抗腫瘤活性的新型聯(lián)合療法中受益。”盡管目前已有多款靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抗體藥物，我們仍然在尋找更多的免疫檢查點，研究它們的作用機制，以期開發(fā)新型的更有效的免疫療法。此外，對免疫檢查點藥物藥效機理的研究也至關重要，這有助于提高藥物響應率、降低耐藥性、改善患者預后。

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賽業(yè)生物CTLA-4/LAG3 雙免疫檢查點人源化小鼠

品系背景：C57BL/6N

品系構建策略：

CTLA-4/LAG3雙免疫檢查點人源化小鼠模型（hCTLA-4/hLAG3）由hCTLA-4小鼠和hLAG3小鼠雜交得到。hCTLA-4和hLAG3的表達均受內源性小鼠啟動子調控。

品系說明：

☑ hCTLA-4和hLAG3在小鼠體內具有正常的生理表達和調節(jié)模式。

☑ CTLA-4和LAG3胞外域人源化，利于CTLA-4和hLAG3靶向藥物的識別。

☑ 保留小鼠CTLA-4和LAG3胞內域，保證正常的胞內信號轉導。

☑ 小鼠靶基因不表達，避免交叉反應。

☑ 小鼠的免疫系統(tǒng)功能健全。

研究應用：

本模型可用于評估hCTLA-4和/或hLAG3靶向藥物在免疫健全小鼠體內的有效性及安全性。

模型驗證：

1. CTLA-4表達檢測

圖1. hCTLA-4在hCTLA-4/hLAG3 小鼠中的表達模式與mCTLA-4在野生型小鼠中的表達模式一致。

從hCTLA-4/hLAG3小鼠中分離脾細胞，用αCD3/αCD28抗體和mIL-2激活2天（A，B）或指定時間（C，D），檢測hCTLA-4和mCTLA-4的表達情況：（A）Tregs（viable, CD3+CD4+ CD25+Foxp3+）；（B）傳統(tǒng)CD4+ T細胞（viable, CD3+ CD4+ Foxp3-）；（C，D）CD8+ T細胞（viable, CD3+ CD8+）。

2. LAG3表達檢測

圖2. hLAG3 在hCTLA-4/hLAG3 小鼠中的表達模式。

從hCTLA-4/hLAG3小鼠中分離脾細胞，用αCD3/αCD28抗體和mIL-2激活2天（A，B）或指定時間（C，D），檢測hLAG3和mLAG3的表達情況：（A）Tregs（viable, CD3+CD4+ CD25+Foxp3+）；（B）傳統(tǒng)CD4+T細胞（viable, CD3+CD4+Foxp3-）；（C，D）CD8+ T細胞（viable, CD3+ CD8+）。

除了hCTLA-4/hLAG3小鼠外，賽業(yè)生物還可以為你提供一系列的單免疫檢查點以及雙免疫檢查點人源化小鼠，如有需要，歡迎聯(lián)系我們咨詢~

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參考文獻：

[1] Huang C.T., Workman C.J., Flies D., et al. (2004) Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21(4):503-13.

[2] Shan C, Li X, Zhang J. (2020). Progress of immune checkpoint LAG-3 in immunotherapy. Oncol Lett. 20(5):207.

[3] Brignone, C., Grygar, C., Marcu, M., et al. (2007). A soluble form of lymphocyte activation gene-3 (IMP321) induces activation of a large range of human effector cytotoxic cells. J. Immunol. 179, 4202–4211.

[4] Andrews L.P., Marciscano A.E., and Drake C.G., et al. (2017). LAG3 (CD223) as a cancer immunotherapy target. Immunological reviews 276,1: 80-96.

[5] Huard B., Mastrangeli R., Prigent P., et al. (1997). Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 27;94(11):5744-9.

[6] Wang J., Sanmamed M.F., Datar I., et al. (2019). Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3. Cell. 176(1-2):334-347.e12.

[7] Ruffo E., Wu R.C., Bruno T.C.,et al. (2019). Lymphocyte-activation gene 3 (LAG3): The next immune checkpoint receptor. Semin Immunol. 42:101305.

[8] Maruhashi, T., Okazaki, Im., Sugiura, D. et al. (2018) LAG-3 inhibits the activation of CD4+ T cells that recognize stable pMHCII through its conformation-dependent recognition of pMHCII. Nat Immunol . 19, 1415-1426.]