國自然熱點是近幾年國自然申請的風向標，結合國自然熱點為課題方向，能有效提高國自然申請的中標率。在歷年的國自然資助中，腫瘤免疫基金中標數逐年遞增且增量可觀。眾所周知，腸道微生物是當今比較火的科研熱點，相關的研究成果更是頻頻登上各大頂級期刊，而且有大量的研究表明腸道微生物對腫瘤免疫治療具有重要的影響。今天就分享一篇發表在Science上的一篇文章，希望能為您的選題有所幫助：

近來，許多研究表明一些腸道菌群的存在與ICB療效的提高有關。為了弄清其中潛在的分子機制，Kathy D. McCoy團隊篩選并研究了多種能顯著提高ICB療效的腸道菌群，發現Bifidobacterium pseudolongum可通過代謝物肌苷（inosine）來增強免疫應答。2020年9月，他們的研究結果發表在了頂級學術期刊Science上：Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy [1]。

研究人員首先在偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結直腸癌（colorectal cancer，CRC）小鼠模型上尋找與ICB療效相關的菌群；然后在皮下接種了MC38（小鼠結直腸癌細胞系）的無菌小鼠模型中篩選可顯著提高ICB療效的腸道菌群（使用無菌小鼠模型可控制菌群種類變量），并研究潛在的分子機制；最后在多種不同類型的腫瘤小鼠模型上進行了驗證。

為了探究ICB療法在AOM/DSS誘導的CRC小鼠模型中的有效性，研究人員對小鼠進行CTLA-4抗體和PD-L1抗體處理。結果顯示，相比對照組，使用同等劑量的兩組ICB實驗組中腫瘤的數量和重量明顯減少、干細胞樣腫瘤細胞比例降低。研究人員接下來對小鼠腫瘤進行了測序。測序結果顯示，盡管兩組的糞便菌群總體組成沒有明顯差異，但ICB實驗組的糞便菌群多樣性更高，且一些菌群顯著增多。

由于原位腺癌模型中腸道菌群數量有限，腫瘤演進嚴重受阻，研究人員決定接下來轉為使用皮下異位接種MC38的無菌或SPF級小鼠模型。利用CRC異位移植模型，研究人員篩選出了3種腸道菌群。單菌移植這些菌群到CRC異位移植無菌小鼠中能顯著提高CTLA4抗體的療效，而其中，B. pseudolongum也能顯著提高PD-1抗體療效。因此，研究人員決定選取B. pseudolongum進行接下來的抗腫瘤免疫機制研究。
 

圖1. 篩選能增強ICB療效的菌群

研究人員發現只進行B. pseudolongum單菌移植而不進行ICB處理并不能誘導抗腫瘤免疫反應，這說明抗腫瘤免疫反應依賴于ICB的存在。此外，在CRC異位移植小鼠模型中，研究人員并沒有在腫瘤中發現B. pseudolongum的存在。這些數據表明ICB療效的增強并不依賴于腫瘤中B. pseudolongum的存在，可能有可溶性因子參與其中。此外，胃腸道炎癥是CTLA-4抗體療法常見的一種副作用。據此，研究人員提出假設：CTLA-4抗體處理導致了腸道屏障完整性受損，腸道通透性增高，進而引起了B. pseudolongum代謝物全身系統性易位的增高。為了探究這個假設，研究人員收集了CTLA-4抗體處理且B. pseudolongum單菌移植或不移植菌群的MC38荷瘤無菌小鼠的血清，并將這些血清輸入到CTLA-4抗體處理的MC38荷瘤無菌小鼠體內。結果顯示，只有來源于CTLA-4抗體處理加上B. pseudolongum單菌移植的小鼠血清能顯著抑制荷瘤無菌小鼠體內腫瘤的生長。這說明血清中來源于或是由B. pseudolongum誘導產生的可溶性因子是ICB療效增強的原因。根據血清樣本的非靶向代謝組學（untargeted metabolomics）、細菌培養上清液成分分析和體內實驗，研究人員發現了B. pseudolongum的代謝物肌苷。
 

圖2. B. pseudolongum和ICB處理對Th1細胞表型的影響及促進免疫療效的代謝物肌苷的鑒定

特別地，肌苷能與腺苷2A受體（A2AR）結合。在一些報道中顯示，它們的結合在體外實驗中對Th1分化有抑制作用；在體內實驗中對抗腫瘤免疫有抑制作用。但也有小部分研究表明肌苷類似物有促炎反應，A2AR信號可以維持Th1在小鼠體內的抗腫瘤免疫作用。基于這些“矛盾”的報道，研究人員探究發現，肌苷對Th1的作用是由環境決定的：在有外源IFN-γ存在的情況下，肌苷促進初始T細胞分化為Th1；當IFN-γ不存在時，肌苷抑制Th1的分化。接下來，研究人員探究了肌苷促Th1分化的分子機制。結果顯示：當A2AR信號被阻斷時，肌苷的促Th1分化作用失效；加入cAMP（A2AR的下游信號分子）后，肌苷的促Th1分化作用恢復；而阻斷蛋白激酶A（cAMP的下游信號分子）后，肌苷的促Th1分化作用失效。此外，inosine-A2AR-cAMP-PKA信號通路能導致cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）的磷酸化，而CREB是已知的Th1關鍵分化因子（e.g. IL-12R和IFN-γ）的轉錄增強子。隨后，研究人員探究了T細胞表面A2AR在B. pseudolongum增強ICB療效中的必要性。結果顯示A2AR的缺失會降低B. pseudolongum對ICB療效的增強效果。

為了弄清肌苷是否能在沒有B. pseudolongum的情況下促進CTLA-4抗體誘導的抗腫瘤免疫作用，研究人員對MC38荷瘤無菌小鼠進行肌苷或PBS口服/全身性給藥，并加入CTLA-4抗體和共刺激信號CpG。與PBS對照組相比，加入CTLA-4抗體和CpG后，肌苷口服和全身性給藥組的腫瘤重量都出現降低，抗腫瘤免疫作用增強。相反地，在沒有CpG的情況下，肌苷處理組的腫瘤重量上升，抗腫瘤免疫作用下降。這與之前的實驗結果一致：肌苷的抗腫瘤免疫作用是由環境決定的（取決于共刺激信號的存在與否）。另外，肌苷的抗腫瘤免疫作用也取決于T細胞上的A2AR：過繼性輸入A2AR缺失的T細胞到Rag1敲除（無T、B細胞）的MC38荷瘤無菌小鼠體內，小鼠口服肌苷并不能引起抗腫瘤免疫反應。這些數據說明肌苷介導了B. pseudolongum對ICB療效的增強效果，且這種效果特異性地取決于T細胞上的A2AR。
 

圖3. 肌苷促進Th1細胞的活化與抗腫瘤免疫作用

由于在多數腫瘤免疫反應中，Th1一般被認為起到抗腫瘤免疫作用，因此研究人員決定在其他腫瘤小鼠模型上驗證肌苷聯合共刺激信號是否能夠增強ICB療效。實驗結果表明：使SPF級Msh2LoxP/LoxPVillin-Cre小鼠（自發小腸腺癌）口服肌苷，并給予CTLA-4抗體和CpG共刺激，小鼠體內腫瘤重量明顯下降，脾臟內IFN-γ+CD4+ 和 IFN-γ+CD8+ T細胞數量顯著升高；在膀胱癌和黑色素瘤小鼠模型上也能觀察到類似結果。
 

圖4. 代謝物肌苷能在小腸癌、膀胱癌和黑色素瘤小鼠模型中增強免疫療法的效用

綜上，研究人員發現，自ICB處理的小鼠CRC腫瘤上分離出的B. pseudolongum菌群是一種重要的小腸共生菌群，它的代謝物肌苷能顯著增強ICB療法的有效性。而且對人類糞便菌群宏基因組進行分析發現，盡管差異不是非常顯著，但相比于在ICB療法無應答患者中，ICB療法應答患者中的B. pseudolongum菌群數量更多；而且在屬水平上，ICB療法應答患者中的B. pseudolongum菌群也更豐富：B. longum和B. adolescentis都有明顯富集。這種菌群代謝物介導的免疫途徑可用于研發CRC或其他癌癥中基于菌群的免疫輔助療法。此外，研究還發現A2AR對B. pseudolongum增強ICB療效十分重要，因此在使用A2AR阻斷劑進行腫瘤免疫治療的時候要注意這種做法可能會消除有益菌群的抗腫瘤作用。

參考文獻：
[1] L. F. Mager et al. Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy. Science 10.1126/science.abc3421(2020).