想獲得國自然選題思路，提高國自然基金申請命中率？想調整研究方向，獲得學術研究突破口？有機會發高分文章？你需要了解學科發展態勢和未來走向！賽業生物專欄《Gene of the Week》每周會根據熱點研究領域介紹一個基因，詳細為您介紹基因基本信息、研究概況和應用背景等，助您保持學術研究敏銳度，提高科學研究效率，期待您的持續關注哦。今天我們要講的主角是經典的免疫檢查點蛋白——CTLA-4。

CTLA-4（細胞毒性T淋巴細胞抗原4；也稱為CD152）是免疫球蛋白家族的成員，在小鼠體內是由Ctla-4基因編碼，在人體內是由CTLA4基因編碼的一種跨膜蛋白，主要表達在活化T細胞表面，特別的是，它在調節性T細胞（Treg）中組成型表達。

CTLA-4與上周我們提到的CD28具有高度同源性，而且它們有著相同的配體CD80（也稱為B7-1）和CD86（也稱為B7-2），但是它們的功能截然相反。CD28屬于共刺激性（co-stimulatory）免疫檢查點，負責向T細胞傳遞激活信號，促進T細胞分化、增殖為效應細胞；CTLA-4屬于共抑制性（co-inhibitory）免疫檢查點，負責向T細胞傳遞抑制信號，抑制T細胞的活性。特別的是，CTLA-4與CD80/CD86的親和力更高，可競爭和阻斷CD28對T細胞的激活作用（圖1）。除此之外，與共抑制性免疫檢查點PD-1不同（腫瘤細胞會通過高表達其配體PD-L1和PD-L2來實現免疫逃逸），CTLA-4的配體CD80/CD86主要表達在APC表面，而在多數的腫瘤組織及細胞中低表達或不表達。

圖1. CTLA-4是一種跨膜蛋白[1]，它與CD28有相同的配體CD80（B7-1）和CD86（B7-2）。CTLA-4與CD80/CD86的親和力更高，可競爭和阻斷CD28和其配體的結合，從而抑制CD28對T細胞的激活作用。

作為一個經典的免疫檢查點蛋白，靶向CTLA-4的抗體藥物研究十分熱門。但是，目前美國FDA批準上市的CTLA-4免疫檢查點抑制劑只有一種：Ipilimumab（伊匹單抗，商品名Yervoy，也稱為Y藥），由百時美施貴寶（Bristol-Myers Squibb，BMS）公司研發，用于治療晚期轉移性黑色素瘤。

此外，值得一提的是目前還有一款由阿斯利康（AstraZeneca）公司研發的靶向CTLA-4的候選藥物：Tremelimumab（替西木單抗）。這款候選藥物的臨床研究進展異常曲折：2015年由FDA授予治療惡性間皮瘤（malignant mesothelioma，MM）的孤兒藥地位；2017年宣布III期臨床研究MYSTIC失敗；2019年宣布III期臨床研究NEPTUNE失敗；2020年2月又由FDA授予治療肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）的孤兒藥資格; 同年3月又宣布另一項III期臨床研究DANUBE失敗。由衷希望2021年能聽到一些好消息，為腫瘤患者們帶來新希望。

除此以外，近期，目前流行的CTLA-4免疫抑制劑作用機制也受到了挑戰（圖2）。2018年，美國馬里蘭大學的Yang Liu教授和Zheng Pan教授團隊提出質疑[2]： 抗CTLA-4抗體可能是通過由巨噬細胞介導的抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（Antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）或由NK細胞介導的抗體依賴的細胞毒性（Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）來選擇性的清除腫瘤細胞中的免疫抑制性的調節性T細胞（圖3）。

圖2. 目前流行的CTLA-4免疫抑制劑作用機制：阻斷CTLA-4免疫檢查點導致了抗腫瘤免疫效果。T細胞活化需要雙重信號。信號1來源于APC上的抗原-MHC復合物與T細胞上的TCR結合；信號2來源于APC上的B7分子（CD80或CD86）與T細胞上的共刺激性受體CD28結合。活化的T細胞上調其細胞表面CTLA-4的表達。而共抑制性受體CTLA-4與CD80/CD86的親和力更強，它與CD28競爭配體CD80/CD86，并抑制T細胞的活性，為T細胞的激活踩下“剎車”。抗CTLA-4抗體被認為松開了對初始T細胞的“剎車”，并準許它們在淋巴結中被激活，然后遷移到腫瘤部位對腫瘤細胞進行殺傷。

圖3. 新的CTLA-4免疫抑制劑作用機制：選擇性清除腫瘤微環境中的調節性T細胞（Treg）導致了抗腫瘤免疫效果。腫瘤中調節性T細胞表達高水平的CTLA-4蛋白，因此抗CTLA-4抗體可能是通過由巨噬細胞介導的抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（Antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）或由NK細胞介導的抗體依賴的細胞毒性（Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）來選擇性的清除這些Treg。阻斷CTLA-4與其配體CD80/CD86的結合對有效清除腫瘤中的Treg來說并不是必需的。

綜上，CTLA-4蛋白在抑制T細胞活性中具有重要作用，針對它的免疫抑制劑是目前上市的三類免疫檢查點抑制劑之一（另外兩類是PD-1和PD-L1免疫檢查點抑制劑）。此外，這些藥物還在不斷擴大其適應癥，并與其他腫瘤免疫藥物進行聯用以提高療效（例如CTLA-4抗體與PD-1抗體聯合免疫療法、CTLA-4抗體與以IL-13Rα2為靶點的CAR-T細胞聯合免疫療法），但關于CTLA-4免疫抑制劑的具體作用機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] https://pdb101.rcsb.org/learn/structural-biology-highlights/tuning-immune-response-with-costimulation.

[2] Tang F., et al. Anti-CTLA-4 antibodies in cancer immunotherapy: selective depletion of intratumoral regulatory T cells or checkpoint blockade? Cell & Bioscience 8: 30 (2018).

賽業生物CTLA-4人源化小鼠，助力腫瘤研究

品系背景：C57BL/6N

品系構建策略：

在小鼠基因組上的Ctla-4基因位點敲入人源CTLA-4胞外區域編碼序列，使其能夠表達：a）嵌合型Ctla-4蛋白（人源胞外結構域和鼠源胞內結構域）和b）可溶性嵌合體蛋白（人源胞外結構域）。

品系說明：

• CTLA-4基因的胞外域完全被人源化。
• hCTLA-4在小鼠體內表達具有正常的生理表達和調節模式。
• 保留了小鼠CTLA-4胞內結構域，保證了正常的胞內信號轉導。
• 小鼠的免疫系統功能健全。
• 缺乏小鼠靶基因的表達，從而避免交叉反應。

研究應用：

hCTLA-4小鼠能夠在完全具有免疫能力的小鼠中進行針對人類免疫檢查點CTLA-4的免疫腫瘤學藥物的體內療效評估和分析。您也可以委托賽業生物構建條件性基因敲除CTLA-4小鼠對藥物的靶向性和毒性進行組織特異性評估。

模型驗證：

圖4. CTLA-4小鼠中各類免疫細胞（T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞、單核細胞）與WT小鼠的各類免疫細胞的比例接近，小鼠免疫細胞功能正常。

圖5. hCTLA-4的功能：α-human CTLA-4單抗下調，hCTLA-4小鼠Treg對效應T細胞的抑制。

用CFSE標記分離的CD4⁺CD25^-T細胞（效應T細胞），并用可溶性αmCD3和APC ^+/-（CD4⁺CD25⁺）Treg和CTLA-4抗體激活。（A）流式細胞術檢測CFSE稀釋；（B）通過ELISA在上清液中測定IL-2的產生。

圖6. hCTLA-4在hCTLA-4小鼠體內的表達模式與野生型小鼠中mCTLA-4的表達模式一致。

hCTLA-4和mCTLA-4在αCD3活化的脾細胞表達情況。hCTLA-4小鼠模型和野生型小鼠上表達的（A）Treg亞群（CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)，（B）傳統CD4⁺（CD3⁺CD4⁺）和（C）CD8⁺（CD3⁺CD8⁺）T細胞。

圖7. 在CTLA-4人源化小鼠中，CTLA-4單抗（Ipilimumab）具有抗腫瘤活性。

小鼠腫瘤模型是研究腫瘤發生發展機制、藥物篩選及療效評價必不可少的工具，賽業生物模式動物創新藥物研發平臺可以為您提供多種類型腫瘤模型，如BALB/c nude（裸鼠）、NOD scid、C-NKG和BRGSF等免疫缺陷鼠、免疫檢查點人源化小鼠、腫瘤細胞系移植模型、人源腫瘤組織異種移植模型（CDX）、基因修飾模型及表型分析服務，如有需要，歡迎聯系我們~