當我們提到“safe harbour”，你首先想到的什么呢？我們今天要討論的不是船只安全停泊的港口，而是小鼠基因組中外源基因定點整合的安全位點。接下來就讓我們一起探索小鼠基因組中的最經典的安全位點之一：Rosa26，作為基因組中的安全位點是種怎樣的體驗吧。

Rosa26：安全這塊我拿捏的死死地！

隨機整合存在哪些問題？

利用細胞系或者模式生物研究基因功能時，通常會通過功能缺失或獲得（gain of function/loss of function）策略來研究靶基因在細胞或者動物內的具體功能和調控機制。功能獲得通常通過基因敲入技術從而促使基因過表達實現，而功能缺失通常通過基因敲除方式獲得。在本文主要討論基因敲入模型。基因敲入（過表達）是指利用轉基因或同源重組等方式將外源功能基因或片段插入到基因組中，使其在細胞內持續發揮功能的技術。

傳統轉基因技術制備的小鼠，由于轉入的基因是隨機整合的，可能出現整合位點和拷貝數不確定等問題，因此需要通過對后代的篩選才能獲得蛋白表達穩定的小鼠。再加上傳代后拷貝數稀釋以及轉入位點容易導致周圍基因沉默等原因，同種首建鼠的表型在傳代過程中容易丟失，給后期的建系、重復試驗帶來諸多不便。

那么是否存在一個不需要篩選又能讓轉入基因穩定高表達并且也不影響轉入基因附近其他基因表達的位點呢？要想避開篩選并獲得基因穩定表達的小鼠，就需要為外源基因提供一個安全可靠的停泊“港口”，在這些“港口”，外源基因既可穩定高效表達，又對細胞和組織無副作用。

Rosa26的發現

研究人員在小鼠基因組中嘗試了各種不同的基因插入位置，他們發現有一兩個位點很特別，在這些位點放置任何DNA序列都非常安全穩定，其中就有Rosa26位點。Rosa26的發現可能是基因改造史上最令人興奮的發現之一，并被視為整個遺傳學史上最重要的突破之一。

Rosa26最早是由Friedrich和Soriano在研究小鼠胚胎干細胞基因突變時發現的。Rosa26在科學界被稱為Gt(ROSA)26Sor, 是一個位于小鼠6號染色體上由三個外顯子構成的非編碼基因，因為該區域極易進行基因插入操作，且由于其尚未發現功能性表達蛋白，加之容易進行同源重組，插入該區域的蛋白可以很好的進行表達，不會影響其他內源性基因的表達和功能發揮，在所有細胞類型和發育階段均有廣泛表達，所以小鼠的Rosa26位點常常被用作基因打靶的安全位點。

Rosa26位點基因敲入模型分類

一般來說，有三種不同類型的Rosa26位點敲入：

● 第一種類型也是最原始版本，即敲入基因的cDNA是由ROSA26啟動子控制并在體內組成性表達的（圖a）。具體來說，接著cDNA的剪接受體（splice acceptor, SA)序列的感興趣的轉基因被插入到Rosa26基因第一個內含子內的Xba1限制性酶切位點。在轉基因的上游插入一個由新霉素抗性基因（NeoR，陽性選擇標記）和三個聚腺苷酸（pA）位點組成的終止轉錄盒（STOP casscatte）。

● 第二種策略為條件性敲入，也就是第一種策略的變體，通過分別插入位于終止轉錄盒（STOP casscatte）兩側的loxP位點來實現的（圖b）。在這種情況下，終止轉錄盒的存在可以阻止轉基因的表達，而與表達Cre小鼠交配的方式，可以通過同源重組去除終止轉錄盒（STOP casscatte）序列。然而，中等強度的Rosa26啟動子在某些情況下可能無法達到期望的轉基因表達水平。

● 為了克服這一限制，第三種策略就是引入外源性啟動子或增強子（如CAG啟動子）來驅動Rosa26位點的高轉基因表達（圖c）。此外，為了監測轉基因在體內的表達，可以在轉基因下游克隆一個兩側有frt位點的IRES-GFP盒。

圖片來源：Creative Biolabs官網

Rosa26的應用

Rosa26位點靶向方法允許高頻率的正確插入和穩定的單拷貝基因插入表達。結合Cre-loxp系統，可以實現對基因表達的時間和細胞類型的特異性控制。更重要的是，作為一種靶向基因敲入策略，所需的小鼠數量比BAC轉基因和PiggyBac轉基因要少，大大提升了工作效率，降低了生產成本。目前，利用Rosa26構建的模型已廣泛應用于基因功能、機體發育機制以及藥物開發等研究。

1. 實現小鼠的全身表達。利用Rosa26的廣譜性表達特性可以實現外源基因在動物機體所有組織和細胞中的表達，如表達某些標記基因，即可實現對細胞及組織器官的標記。

2. 作為基因打靶的安全位點之一，可用于某些待研究蛋白的過表達。

3. Rosa26品系是表現出廣泛lacZ染色的幾種品系之一。Rosa26小鼠似乎在所有造血細胞以及胚胎的所有組織中表達lacZ，因此它對許多應用非常有用，比如嵌合體分析。

4. 將報告基因或毒素基因插入到Rosa26位點已廣泛用于特定細胞譜系示蹤，尤其是利用Cre-loxp位點特異性重組系統制備的細胞譜系示蹤模型和重組酶介導的基因交換模型最為典型。

目前，賽業利用Rosa26位點已經建立了上千種基因敲入小鼠模型，除小鼠外，賽業生物還提供在大鼠和胚胎干細胞Rosa26位點的基因靶向修飾的服務，這些模型廣泛應用于基因功能、疾病診斷與治療、干細胞功能與應用、RNAi等領域。在小鼠、大鼠和胚胎干細胞中靶向修飾Rosa26，將有效解決常規轉基因修飾造成的諸多問題，為外源基因表達穩定、表型一致的模型提供有效的途徑，必將推進基因修飾模式動物的研究和應用。