減數分裂為生殖細胞所特有的生物學事件，是生物有性生殖的基礎。在減數分裂過程中，同源染色體的非姐妹染色單體間發生配對、聯會和重組交換，而非同源染色體分配時自由組合，從而使配子呈現遺傳多樣化，增加了后代的適應性【1】。因此，減數分裂是保證物種繁衍、染色體數目穩定和物種適應環境變化而不斷進化的基本前提。遺傳變異是否與表觀遺傳調控有關是學術界長期關注的問題，本研究為回答該問題提供了一些重要線索。

同源重組是減數分裂的核心事件，它不僅是減數分裂過程中遺傳物質交換的基礎，也是同源染色體正確分離的保障。其過程高度復雜且受到嚴密調控。以小鼠為例，減數分裂同源重組起始于SPO11和GM960復合物所介導的DNA雙鏈斷裂 (Double-Stranded Breaks, DSBs)；隨后，斷裂位點經5’末端切割、單鏈入侵等而使DSB獲得修復；最終在同源染色體之間形成交叉（Crossover）或非交叉（Non-Crossover）【2】，其中，大部分DSBs修復形成非交叉，大約僅有10% DSBs修復生成交叉。

DSB位點并非隨機分布，而是具有明顯的偏好性，稱之為熱點（hotspot）。盡管已知PRDM9及其介導的H3K4me3修飾在在多數哺乳動物DSB熱點選擇中發揮著關鍵作用【3-5】，但是，關于PRDM9介導的H3K4me3在DSB修復過程中是如何演化的，PRDM9及其介導的H3K4me3是否參與調控DSB修復過程即同源重組命運決定，以及其它表觀修飾因子是否也在其中發揮作用，等等，目前均不清楚。因為難以獲取高純度的各種亞型的哺乳動物減數分裂前期I細胞，所以同源重組命運決定機制一直是哺乳動物減數分裂研究的難點和熱點。

2020年2月11日，中科院分子細胞卓越創新中心（上海生物化學與細胞生物學研究所）童明漢課題組與復旦大學生物醫學研究院/附屬中山醫院藍斐課題組、北京大學湯富酬課題組合作在Cell Research上發表論文“Refined spatial temporal epigenomic profiling reveals intrinsic connection between PRDM9-mediated H3K4me3 and the fate of double-stranded breaks”。

與之前PRDM9決定DSB熱點研究不同，該文提出PRDM9及其介導的H3K4me3協同局部染色質環境可能參與了DSB修復過程，與同源重組命運決定相關；發現早期生成的DSBs更傾向于修復形成交叉。本文不僅為同源重組命運決定和交叉穩態的調控研究提供了新視角，也證實了遺傳物質交換機制和表觀遺傳調控的相關性。

南模生物為該研究提供了Prdm9-3×(HA-Flag)、Lin28-YFP、Stra8-GFPCre、Vasa-mCherry小鼠模型。
 

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得益于童明漢課題組前期建立的分離小鼠任意類型生精細胞的技術體系，使獲取高純度同步發育的任意類型生精細胞成為現實，因此有可能對精子發生過程中關鍵生物學事件的分子機制進行精細研究。比如，童明漢課題組曾經基于上述體系與湯富酬、李勁松課題組合作，2018年7月30日在Cell Research上發表了題為“Single-cell RNA-seq uncovers dynamic processes and critical regulators in mouse spermatogenesis”的論文，繪制了精子發生過程中生精細胞轉錄組的動態變化圖譜，系統地闡明了這種動態變化的可能分子基礎，為哺乳動物精子發生調控的分子機制研究提供了基礎數據【6】。
 

圖1: 基于精細分期的減數分裂重組過程表觀遺傳組的建立

作為減數分裂系列研究的一部分，為了闡明表觀遺傳是否以及如何調控減數分裂同源重組，本文在純化各級生精細胞的基礎上，將減數分裂前期I細胞細分為7個時期進行研究（圖1），結合ChIP-seq技術，分析了包括H3K4me3在內的8種組蛋白修飾在減數分裂前后的動態變化；應用NOMe-seq，觀察了DNA甲基化以及染色質開放狀態的動態變化（圖1），揭示了之前難以發現的減數分裂前期I細胞演化的未知規律。
 

結果顯示，PRDM9介導的H3K4me3修飾在細線期(Leptotene)開始生成，至偶線期中期達到峰值，隨后逐步消失（圖2a）；同時，越早產生的H3K4me3越晚消失。這種H3K4me3動態變化與DSB修復過程中同源重組中間產物的演變高度相關，提示PRDM9介導的H3K4me3可能參與了DSB修復過程。根據生成和消失時間，研究人員繼而將與重組熱點相關的H3K4me3分為四種類型，發現早期產生的H3K4me3信號強度與寬度均最強，且富集了更長的PRDM9結合基序（圖2b-e）；那些快速消失的H3K4me3信號強度與寬度均最弱，且為較晚產生。這些結果表明早期生成的PRDM9介導的H3K4me3可能通過影響同源重組穩定中間體dHJ(double Holliday Junction)，從而進一步調控交叉形成；而那些弱而快速消失的則指導生成非交叉。
 

與H3K4me3相比，H3K4me1修飾在重組熱點上出現得更早，消失得更晚，并且覆蓋了更多的核小體（圖3）。有意思的是，在偶線期階段可以明顯觀察到DSB核心區域核小體H3K4me1被H3K4me3所替代的情況。鑒于體外實驗證實PRDM9具有催化H3K4me1的活性，研究人員推測H3K4me1可能是PRDM9催化產生H3K4me3過程的中間態；而早出現的H3K4me1則提示重組熱點決定發生的時間可能更早。
 

圖3：重組熱點相關H3K4me1修飾的特性

除上述修飾外，本研究還發現了H3K36me3與H3K27ac也富集于重組熱點，而H3K9me2修飾則缺失于重組熱點；同時，觀察到重組熱點區域的染色質與全基因組相比更加開放。有意思的是，不論H3K36me3與H3K27ac的富集，還是H3K9me2的缺失，抑或染色質的開放，均隨Prdm9敲除而變化，表明上述表觀因子均為PRDM9依賴性的。與H3K4me3類似，相比于其它類型，早期產生的H3K36me3與H3K27ac具有更強的信號強度與寬度，染色質也最為開放，提示H3K36me3, H3K27ac以及染色質開放可能與H3K4me3一起共同在DSB命運決定中發揮調控作用。同時，研究者根據所上述表觀遺傳規律，發現了4537個潛在的DSB熱點，其中置信度最高的302個位點值得后續進行深入的機理分析。
 

綜上所述，本研究系統地闡述了PRDM9介導的H3K4me3以及H3K4me1、H3K36me3、H3K27ac、H3K9me2和染色質開放在減數分裂過程及其前后的動態變化，闡明了PRDM9及其介導的H3K4me3修飾與DSB命運決定的相關性，提出了“PRDM9及其介導的H3K4me3修飾不但能決定DSB位點選擇，而且可能調控DSB形成后的修復過程，從而決定DSB命運”的假說（圖4）。該假說將是相關團隊的下一個重點研究目標。
 

圖4：DSB命運決定的表觀遺傳學基礎

據悉，中國科學院分子細胞卓越創新中心（上海生物化學與細胞生物學研究所）陳瑤博士，復旦大學呂瑞途博士、榮博文博士生，北京大學未來基因診斷高精尖創新中心博士生鄭宇軒與中國科學院分子細胞卓越創新中心（上海生物化學與細胞生物學研究所）林震博士為共同第一作者。該工作受到了中國科學院分子細胞卓越創新中心動物實驗技術平臺和細胞分析技術平臺的大力支持

參考文獻

1. Baudat, F., Imai, Y. & de Massy, B. Meiotic recombination in mammals: localization and regulation.Nat Rev Genet 14, 794-806, doi:10.1038/nrg3573 (2013).

2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol 7, doi:10.1101/cshperspect.a016618 (2015).

3. Baudat, F. et al. PRDM9 is a major determinant of meiotic recombination hotspots in humans and mice. Science 327, 836-840, doi:10.1126/science.1183439 (2010).

4. Myers, S. et al. Drive against hotspot motifs in primates implicates the PRDM9 gene in meiotic recombination. Science 327, 876-879, doi:10.1126/science.1182363 (2010).

5. Parvanov, E. D., Petkov, P. M. & Paigen, K. Prdm9 controls activation of mammalian recombination hotspots. Science 327, 835, doi:10.1126/science.1181495 (2010).

6. Chen, Y. et al. Single-cell RNA-seq uncovers dynamic processes and critical regulators in mouse spermatogenesis. Cell Res 28, 879-896, doi:10.1038/s41422-018-0074-y (2018).