前言

THP-1 是人外周血的單核細胞系，最初來源于急性單核細胞性白血病患者，常被用來體外研究巨噬細胞功能。 它通常屬于懸浮細胞，當用 PMA 處理后可分化為貼壁生長的巨噬細胞。THP-1 能釋放許多細胞因子，其中包括白細胞介素 -8(IL-8)，一種能被許多類型細胞分泌的、在調節急性炎癥反應中發揮作用的細胞因子。IL-8 與許多分析物一樣可以在 96 孔板中被 ELISA 檢測定量。通常 ELISA 實驗需要耗費 4 個小時，而在 Abcam 的 SimpleStepELISA 試劑盒幫助下實驗時間可以縮短至90 分鐘，節約了近三分之二的時間，并且無損實驗的靈敏度和重復性 ( 圖1 )。這里我們介紹了如何使用 hIL-8 SimpleStepELISA 試劑盒以及如何在 SpectraMax ABSPlus 微孔板讀板機上使用 SoftMax Pro 軟件預置的便捷程序來測定 IL-8 的含量。

優點

- 利用 SpectraMax ABS Plus 微孔板讀板機和SimpleStep ELISA 試劑盒定量白細胞介素 -8利用 Abcam SimpleStep ELISA 試劑盒可將 ELISA 實驗時間從 260 分鐘減少到 90 分鐘，無損實驗的靈敏度和重復性
- 在 SpectraMax ABS Plus 微孔板讀板機上，整塊 ELISA 板的讀板時間可減少到 5 秒
- SoftMax Pro 軟件可自動計算樣品濃度和繪制曲線

材料

- hIL-8 SimpleStep ELISA 試劑盒 (Abcamcat. #ab214030）
- THP-1 人外周血單核細胞 (ATCC cat.#TIB-202）
- THP-1培養基
- RPMI-1640培養基（ATCC cat. #30-2001）
- Benchmark胎牛血清（Gemini cat. #100-106）
- β-巰基乙醇（Sigma cat. #M6250-100mL）
- 青-鏈霉素 (10,000 U/mL)（ThermoFisher cat. #15140122)
- SpectraMax ABS Plus微孔板讀板機（Molecular Devices cat. #ABS Plus

方法

準備 THP-1 細胞

96 孔板每孔中預先加入 2 萬個懸浮的未分化的 THP-1 細胞，隨后用2.5 ng/μL 的PMA 或 DMSO（陰性對照）37℃ 處理細胞 48 小時。處理時間結束后收集細胞上清 -80℃ 凍存直至 ELISA 檢測。

ELISA

ELISA 實驗前需融化樣品，2000 g 離心10 分鐘去除細胞碎片，上清液用試劑盒提供的稀釋液按照 1:5，1:10 以及 1:50 比例稀釋。按照試劑盒說明書配制好標準品后，將樣品與標準品加入試劑盒提供的微孔板中。然后每孔加入抗體混合物，孔板密封好后放入搖床室溫震蕩 1 小時。1 小時后用 Wash Buffer PT 洗滌每孔 3 遍，然后加入底物 TMB，暗室內置于搖床上震蕩 15 分鐘顯色。15 分鐘后加入終止液終止反應，并于 SpectraMax ABS Plus 微孔板讀板機上測定 450nm 處吸光度。這一過程可在 SoftMax Pro 軟件預置的便捷程序中實現 ( 參見圖 1 工作流程 )。

結果

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