簡介

雙鏈DNA通常使用微孔板讀板機通過測量DNA溶液的260nm吸收光進行定量。然而，這種方法通常在微孔板讀板機上只能檢測到最低250ng/mL的濃度。對于生物學應用涉及到小體積樣品，如新一代測序和擴增產物定量時，更靈敏的方法才能滿足需求。Life Technologies公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA實驗對于DNA的特異性更好且比傳統的吸收光方法靈敏1000倍。產品信息中標稱在微孔板上進行此實驗，使用單一染料濃度時動態區間可達250pg/mL到1000ng/mL。1此篇應用文章展示使用Molecular Devices公司SpectraMax®熒光微孔板讀板機和Quant-iT PicoGreen實驗，用戶能穩定的檢測低至100pg/mL的雙鏈DNA。

為了最大化實驗的靈敏度，使用最優的激發和發射波長是必要的。不像基于濾色片的讀板機，SpectraMax微孔板讀板機的雙光柵允許用戶選擇儀器標稱范圍內任意波長。確定能產生最佳實驗動態區間的激發和發射波長是很重要的，因為這會與基于濾色片的讀板機有一定區別。

SpectraMax M5熒光微孔板讀板機的最優激發和發射波長如下：490nm激發和525nm發射，515nm發射截取濾色片(注意這些波長可能與Quant-iT PicoGreen產品說明書中針對基于濾色片讀板機的波長有所不同)。SoftMax®Pro軟件中有預設程序用來獲取，展示和分析來自SpectraMax系列讀板機的數據。

優勢

- 靈敏的熒光定量低至 63 pg/mL的DNA
- 線性動態范圍跨四個數量級
- 通過SoftMax Pro軟件中預設的程序簡單的分析結果

材料

- Quant-iT PicoGreen dsDNA實驗試劑盒，包含l ambda DNA標準品(Life Technologies 貨號 #P7589或P11496)
- 褐色96-孔板(Greiner Bio-One, 貨號#655096)
- 棕色或琥珀色 (避光離心管）
- Molecular Devices 帶熒光檢測模式的微孔板讀板機:
- S pectraMax® M3/M4/M5/M5e(cat. #M3 or #M4 or #M5 or M5E)
- SpectraMax® i3x (cat. #i3x)
- S pectraMax® M2/M2e(cat. #M2 or M2E)
- Gemini XPS/EM (cat. #XPS or EM)
- FlexStation® 3 (cat. #FLEX3)
- FilterMax F3/F5 (cat. #F3 or F5)
- S pectraMax® Paradigm(cat. #PARADIGM)
- SoftMax® Pro軟件(Molecular Devices)

方法

儀器設置

- 將微孔板讀板機開機。
- 啟動SoftMax Pro軟件并在Protocols下拉菜單中打開 PicoGreen熒光程序。 針對實驗最優的設置已包含在程序中(見Table 1)。通過點擊“Settings”并在屏幕左側選擇需要讀取的孔并和實驗板類型。
- 點擊“Template”按鈕來打開窗口，在窗口中您可以分配多孔板的孔到預設模板的相應組中。 可以使用下拉菜單來選擇合適的模板組。熒光程序中有多個預設的模板組，包含Standards,Unknowns,和Unknowns_NoDiln (對應稀釋的樣品)。分配孔到當前模板的組中會將程序組表格中所對應的微孔板讀取時獲得的數據進行分組。

準備實驗

實驗方法遵循QuantiT PicoGreen dsDNA試劑和試劑盒中產品信息頁中的指導，除了實驗體積按比例從2.0mL減到200μL來適應96孔微孔板格式。

- 通過使用無DNA酶水20倍稀釋試劑盒中的濃縮緩沖液制備1XTE緩沖液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)。
- 使用TE緩沖液(上面制備的)200倍稀釋濃縮的Quant-iT PicoGreen試劑DMSO溶液來制備水相工作液。推薦在塑料容器中而不是在玻璃容器中制備此溶液，因為試劑有可能吸附在玻璃表面上。通過使用琥珀色或棕色管或用金屬箔包裹將試劑避光。應在試劑制備后幾小時內使用。
- DNA標準曲線：用TE緩沖液制備2μg/mLdsDNA儲液。試劑盒中提供的ambdaDNA標準品可以通過使用TE稀釋50倍來制成2μg/mL溶液。

注意：某些情況下可能需要使用和待測DNA相似的DNA類型制作標曲

- 高濃度范圍標曲可以濃度從1 ng/mL制備到1 μg/mL，低濃度范圍標曲可以從25 pg/mL制備到25 ng/mL。對于高濃度范圍標曲，按Table 2中稀釋方案稀釋；對于低濃度范圍標曲，40倍稀釋2μg/mL溶液制備50 ng/mL溶液，參考Table 3中的稀釋方案。 注意：此篇應用文檔，使用了濃度從1 μg/mL到50pg/mL的一系列標曲。
- 用移液器將100 μL每孔標準品轉移到一個黑色 96-孔微孔板中，最好3個重復。確保向孔中加TE(無DNA)來作為空白孔。
- 加100 μL每孔Quant-iT PicoGreen試劑水相工作液。通過渦旋或震板機室溫避光混合2到5分鐘。

讀取微孔板

- 確保紫色板子適配器(如果您的讀板機需要的話)放入微孔板讀板機的板托中。
- 點擊SoftMax Pro軟件中的Read按鈕。儀器會讀取板子并且相對熒光單位會顯示在程序的板子區塊中。

分析數據

- 微孔板讀取之后，相對熒光單位 (RFUs)會被顯示在板子區塊中。模板建立設定的組表格中的數據會被分析。一套有代表性的組表格中的數據，見Table 4結果區塊。
- 模板中分配指定的標準品會在程序中標準曲線區塊被自動擬合成曲線(并顯示在標準品組表格中)。默認設置是線性曲線擬合，但是擬合寬范圍標曲時可使用loglog曲線擬合。可在曲線圖區曲線擬合下拉菜單中選擇曲線擬合。

結果

使用Quant-iT PicoGreen dsDNA實驗和SpectraMax? M5 微孔板讀板機測定濃度從1μg/mL到50 pg/mL的DNA標準品(MolecularDevices 公司其他熒光微孔板讀板機會得到相似結果)。SoftMax® Pro軟件會對每組標準品重復自動化校準并計算平均RFU，標準偏差，和%CV。使用SoftMax Pro軟件loglog曲線擬合方式擬合標準曲線 (見Figure 1.)使用96孔板微孔板格式觀察到的靈敏度低至63 pg/mL并且標準檢測限通過孔板三倍標準偏差值校準。這數值明顯低于QuantiT PicoGreen實驗產品說明書中標稱的250 pg/mL。Figure 2展示了低濃度端標準曲線。整個標曲范圍的線性都非常好。

結論

Quant-iT PicoGreen dsDNA 實驗，當在使用SoftMax Pro軟件的SpectraMax微孔板讀板機上檢測時，是一種對于雙鏈DNA快速，靈敏的檢測方法。SoftMax Pro軟件的分析能力通過一種方便閱讀，客戶可定制的報告格式提供定量分析。軟件中預設的程序使快速的實驗設置成為可能。

Molecular Devices公司額外的解決方案

SoftMaxProGxP軟件為必須展示符合FDA21CFRPart11的GLP/GMP客戶提供額外的工具和特性。具有優化的硬件和軟件驗證工具來加速和簡便化驗證過程，使展示數據采集和分析的符合性更簡單。

對于更高的通量要求，Molecular Devices的’StakMax®多孔板操作系統能整合SpectraMax讀板機并可實現自動化處理20,40,或50個一批的微孔板。

對于需要檢測極低水平的DNA的客戶MolecularDevices提供Threshold®系統和Threshold總DNA實驗試劑盒。Threshold系統能檢測和定量皮克級污染物，污染物包括總DNA宿主細胞蛋白，牛源污染物(如BSA，IgG，胰島素，鐵傳遞蛋白)，蛋白A和G，和任何能被抗體結合的獨特的蛋白。

更多信息，請訪問www.moleculardevices.com/home.html

參考

1.Molecular Probes Data Sheet MP 07581 (20 December 2005): Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits.