細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的本質(zhì)均為細(xì)胞死亡，但我們可以通過其發(fā)生機(jī)制和病理形態(tài)學(xué)方面所表現(xiàn)出的特征加以區(qū)別。細(xì)胞凋亡指的是細(xì)胞程序性的死亡，不會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞壞死則被認(rèn)為是因病理而產(chǎn)生的被動(dòng)死亡，會(huì)伴隨發(fā)生細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)因子的釋放并引起炎癥反應(yīng)。進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選過程中，區(qū)分引起的是細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞壞死變得非常重要，因?yàn)楹笳叩闹饕�副作用是引起�?xì)胞的炎癥反應(yīng)。這里我們介紹了利用SeptraMax Paradigm（Molecular Devices）和 Vybrant 凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）進(jìn)行這方面的研究。

 

Vybrant 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是基于Annexin V 和Sytox Green 兩種標(biāo)記物的基礎(chǔ)上開發(fā)出的，可以快速和簡便的區(qū)分腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死情況， Annexin V 一種人類血管抗凝劑，標(biāo)記有藻紅蛋白（R-PE）后通常用來檢測凋亡細(xì)胞的發(fā)生，其工作原理是正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin V 是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸具有高度的親和力。相反，Sytox Green 染料不能滲透進(jìn)入活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，但可以進(jìn)入壞死細(xì)胞并對其細(xì)胞核進(jìn)行染色，發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光。我們提前將腫瘤細(xì)胞種在384 孔板中，然后分別使用腫瘤壞死因子（TNF）和更生霉素（Actinomycin-D）來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。此外，我們可通過檢測細(xì)胞組織表達(dá)的不同物質(zhì)其抗腫瘤特性和分化特性來區(qū)分細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。

 

SpectraMax Paradigm 是美國Molecular Devices 公司推出的一種全新概念的多功能檢測平臺(tái)（如圖一）。它將光源系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)獨(dú)立分開，多套檢測器同時(shí)固定在主機(jī)上，針對不同實(shí)驗(yàn)要求選用不同的卡盒，每一種卡盒其實(shí)就是獨(dú)立的光路系統(tǒng)，可以提高了檢測針對性和靈敏性。針對此試驗(yàn)特點(diǎn)，如儀器具有能夠同時(shí)檢測Annexin V 和Sytox Green 兩種標(biāo)記物發(fā)射熒光強(qiáng)度話可大大提高檢測的效率（如圖二），而Paradigm 所具有的雙通道檢測器可同時(shí)工作，非常適合此類試驗(yàn)要求。

 

圖一：SpectraMax Paradigm 多功能檢測平臺(tái)

 

 

圖二. 1:HepG2 細(xì)胞提前24 小時(shí)種在平底的384 孔板中，這些孔中的一部分細(xì)胞未經(jīng)任何處理，而另一部分細(xì)胞試驗(yàn)前18 小時(shí)分別用TNF(25ng/ml)、 Actinomycin-D（1ug/ml）和Triton X-100(0.1%)孵育，然后去除微孔板中培養(yǎng)基，將兩種標(biāo)記物分子溶解在緩沖液中，37度孵育20 分鐘。染色后，分別使用SpectraMax Paradigm 多功能檢測平臺(tái)的single-point(1a)、on-the-fly(1b)和area-scan(1c)模式檢測結(jié)果，每個(gè)柱高度代表著平均熒光強(qiáng)度值（RFU）和5個(gè)重復(fù)孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。可以看出掃描孔內(nèi)面積越大，得出結(jié)果就會(huì)更加的精確，尤其適合像腫瘤細(xì)胞的這種單層不均一類型細(xì)胞的檢測試驗(yàn)。

 

綜上我們可以發(fā)現(xiàn)， SpectraMax Paradigm 是基于細(xì)胞學(xué)應(yīng)用的理想檢測平臺(tái)， 如使用Vybrant 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒所呈現(xiàn)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，孔內(nèi)細(xì)胞層的變化非常快速而且對整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的影響較大，Paradigm 所具有的”O(jiān)n-the-fly”數(shù)據(jù)收集模式可以很好的解決此問題。高速的雙發(fā)射檢測器可針對每個(gè)孔測量的多數(shù)據(jù)點(diǎn)畫出線性圖，從而得到一個(gè)更大測量區(qū)域的數(shù)值，將會(huì)得出更好的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。當(dāng)使用“area scan”功能后可以進(jìn)一步提高基于細(xì)胞學(xué)應(yīng)用試驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。此外，此款儀器所具有的雙通道同時(shí)檢測的功能可以大大縮短檢測時(shí)間，提高工作的效率。

 

非常感謝奧地利克雷姆斯高等專業(yè)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)部門所提供的研究數(shù)據(jù)。