均相高通量方法在活細胞GPCR功能性和表面受體結合試驗中的研究

介紹：

G蛋白偶聯受體（GPCR）是目前已知細胞表面受體家族中最大的一個分支，目前的藥物篩選中有40%是針對GPCR進行的。先導化合物的篩選過程中，首先要針對這些潛在藥物（化合物）進行療效的評估（例如在心血管疾病及其它領域），如果想充分了解這些候選藥物的作用機制，如受體和配體結合、受體聚集或者受體內化等，都需要進行大量的試驗。因此，我們需要建立一個適合高通量篩選工作的高自動化及高靈敏度的試驗方法。Tag-lite細胞篩選平臺設計初衷即是為了提高細胞表面受體研究的靈活性。此平臺可針對藥理特性研究和研發治療性抗體設計出各種各樣不同的試驗方案，非常適合進行大量初篩和復篩工作。這里我們展現出的結果是利用了Tag-lite受體配體結合試驗平臺及SpectraMax® Paradigm 微孔板讀板機進行的GPCR激動劑和拮抗劑研究，其中包括了多巴胺D3、胰高血糖素GLP1和Mu阿片試驗。衡量試驗的關鍵性指標是Z值和窗口值，同時我們也給出了其針對cAMP、pERK和pAKT的試驗結果。

方法：

TR-FRET檢測的原理

HTRF技術（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）是基于TR-FRET技術（即結合了TRF和FRET兩種技術）的基礎上發展而來的。HTRF供體熒光染料分子采用了銪元素（Eu3+ cryptate）或Lumi4®-鋱元素（Tb2+ cryptate）的穴狀化合物，是與Lumiphore公司近期合作成果。很多種受體分子都能作為紅色或者綠色熒光的發射體。當用兩種熒光染料分子標記生物分子相互作用后，通過對穴狀化合物標記的供體分子被激發后，其一部分能量由受體熒光染料分子所捕獲。下圖展示出了TR-FRET在使用Eu3+穴狀化合物作為供體分子和XL665作為受體分子的標準試驗流程和檢測原理。

結果和討論：

Tag-lite 活細胞GPCR結合試驗

Tag-lite檢測平臺使用HTRF染料分子標記你感興趣蛋白質的靶點。Cisbio公司生物檢測系統可提供編碼TAGs標簽和感興趣的蛋白序列的質粒，或者是已構建好質粒轉染后的凍存細胞。當受體的配體（激動劑或拮抗劑）與受體結合后，構建表達標簽的蛋白就可以被鋱元素的穴狀化合物所標記。Tag-lite檢測技術是一個應用廣泛的、理想的檢測平臺，可用于機制研究、受體二聚化、配體結合、第二信使檢測等試驗。

圖一：Tag-lite細胞表面結合試驗原理

cAMP檢測試驗

cAMP檢測試劑盒采用HTRF技術，可以直接從懸浮細胞或者貼壁細胞中對cAMP含量進行檢測。我們采用標記了銪元素（Eu3+ cryptate）的抗cAMP的單克隆抗體作為示蹤分子，免疫競爭方法分析細胞內源性表達的cAMP和標記有d2熒光染料分子的cAMP標品，為了評價SpectraMax Paradigm 和 M5e多功能讀板機在此類試驗中的表現而做的滴度曲線，如下圖所示。

圖二： SpectraMax Paradigm 和SpectraMax M5e多功能讀板機，針對cAMP濃度滴度曲線評價：W =21.4, Z’ = 0.91 . M5e: W = 15.5, Z’ = 0.97

HTRF細胞激酶試劑盒來檢測pAKT和pERK含量

Cellul'erk為基于HTRF技術的檢測試劑方法，可用于磷酸化AKT（Ser473）含量的檢測，此試劑可直接在完整細胞中檢測活化的ERK1/2和AKT。當受體被刺激后，引發了相關激酶的活化，通過該試劑盒就可檢測到細胞裂解液中磷酸化蛋白的含量。磷酸化蛋白的測量應用了雙抗體夾心法，兩個抗體均為單克隆抗體。其中一個為抗磷酸化蛋白的抗體，標記Eu3+；另一個為抗蛋白其它位點的抗體，標記d2。

圖三：刺激后和未刺激的細胞裂解液作為試驗的內部質控條件，來檢測獲得結果的質量，窗口顯示為高低兩個質控

多巴胺D-3結合試驗

多巴胺受體屬于G蛋白偶聯受體家族成員之一，主要分布于脊椎動物的中樞神經系統中，多巴胺受體與許多神經傳導過程有關，包括興奮、認知、記憶和小肌肉發育等，如果多巴胺受體信號傳導異常能夠引起神經系統障礙，因此多巴胺受體是常見測神經性藥物的作用靶點。抗精神病藥物是多巴胺受體的拮抗劑，而精神興奮劑通常是多巴胺受體激動劑。多巴胺D3基于細胞Tag-lite結合試驗，方便檢測其激動劑和拮抗劑，開發全新的抗精神病藥物。

圖四：結合試驗：HEK293細胞表達D3受體標記了Tb穴狀化合物，然后受體與配體結合孵育90分鐘，在兩款儀器上分別設置不同的延遲和檢測時間進行評估，檢測時間越短會加大W和Z’值。

Delay – 20s; Int – 200s
Delay – 20s; Int – 500s

我們分別用SpectraMax Paradigm 和 SpectraMax M5e兩款多功能讀板機優化設置后，評估多巴胺D3 Tag-lite結合試驗的表現，兩歀儀器在競爭抑制試驗的表現結果如下。Paradigm即得出了理想的結果也表選出了無與倫比的便利性，用戶可以更具需要隨時通過購買優化卡盒來升級系統滿足未來的需要。

圖五：競爭抑制試驗，檢測幾個未知的多巴胺受體的激動劑和拮抗劑，并得出IC50s值。細胞孵育在6nM受體配體結合體系中以及一個受體激動劑PPHT和溴麥角環肽或拮抗劑NAPS,兩款儀器得出相似的IC50s值。

優化SpectraMax Paradigm 和 SpectraMax M5e兩款儀器的設置

通過修改延遲時間和檢測時間來進行優化，我們發現當兩臺儀器都縮短了延遲時間和檢測時間會獲得更大的窗口值。

圖六：使用SpectraMax Paradigm儀器設置不同檢測時間和延遲時間會得出不同滴度曲線（左）和試驗窗口值W（右），其優化設置為20us延遲時間，200us檢測時間。

Mu 阿片受體結合試驗：

μ-阿片受體與內啡肽有較高親和力（μ=嗎啡），μ受體激動劑是鴉片生物堿嗎啡。通過受體激動劑來激活μ受體，例如嗎啡鎮能夠鎮痛，鎮靜，降血壓，精神歡快和降低呼吸頻率，長時間或者高劑量使用阿片能夠導致機體耐受下降，如果阿片攝入過量會導致由于機體呼吸困難造成缺氧而死。如果過量攝入阿片可以使用阿片拮抗劑（如納洛酮和納曲酮）來抵消其作用。

這里我們給出了活細胞受體結合試驗的結果，Mu-阿片受體使用Tb/紅色受體（Tag-lite® Dynamic TR-FRET）方法標記，SpectraMax Paradigm多功能讀板機來評價其與配體結合和與不同化合物反應的抑制常量。

圖七：使用SpectraMax Paradigm多功能讀板機系統在Mu-阿片配體結合和競爭抑制試驗的結果（右），試驗窗口和Z值分別是5.3X和0.89。

胰高血糖素 GLP-1結合試驗：

GLP1受體被認為廣泛表達于胰島β細胞中，激活GLP1受體會刺激腺苷環化酶途徑，最終導致胰島素含量增加和釋放，因此GLP1受體作為治療糖尿病潛在靶點，GLP1受體也可以表達于大腦中，參與控制食欲，調節記憶力和學習力等。通過SpectraMax Paradigm多功能讀板機系統來評價胰高血糖素GLP1受體配體結合和競爭抑制試驗過程。

圖八：SpectraMax Paradigm多功能讀板機用于GLP1肽受體激動劑的試驗檢測結果，試驗窗口值和Z值分別是19X和0.78。

結論：

• SpectraMax Paradigm和M5e多功能讀板機在幾個Cisbio試驗中均有出色的表現：cAMP檢測，pERK和PAKT激酶試驗和Tag-lite配體結合和競爭試驗。
• 通過對兩款儀器設置的優化，針對Tag-lite試驗（使用384孔板），通過試驗窗口和Z值對它們的表現進行了評價，結果非常好。
• 縮短SpectraMax Paradigm多功能讀板機的延遲時間和檢測時間，會得出更好結果。
• SpectraMax Paradigm多功能讀板機和Tag-lite技術結合，會成為一個強大的、具有高通量特點的，可研究細胞表面結合和功能性的平臺。