AlphaLISA篩選技術在SpectraMax Paradigm多功能檢測平臺上的應用
Molecular Devices公司的SpectraMax® Paradigm®多功能檢測平臺是市場上唯一一個用戶可升級的微孔板檢測平臺，使用戶可以在不到兩分鐘內對系統進行實時功能配置。如果需要使用Alpha技術，用戶可以在任何時候自己升級。SpectraMax Paradigm平臺能夠快速對TNF-alpha因子進行定量，通過對TNF-alpha刺激的人內皮細胞中細胞因子的定量實現抗炎代謝產物的高靈敏篩選。
AlphaLISA®是一種基于微珠的均相檢測技術，用于在微孔板中研究分子之間的相互作用。可以用于細胞因子的定量以及篩選具有抗炎活性的化合物。和傳統的ELISA方法相比，ELISA需要多次洗滌步驟，而洗滌操作可能破壞貼壁的細胞。AlphaLISA無需洗滌，減少細胞損失，使實驗結果SD值更小，數據更加準確。
TNF-alpha純化和定量
首先，需要獲得純化的TNF-alpha蛋白，用于刺激內皮細胞產生炎癥反應。為此目的，人TNF-alpha因子在Pichia pastoris酵母中進行表達。使用酵母的好處是既可以表達大量的重組蛋白又不會產生干擾細胞水平實驗的內毒素。我們可以從每升酵母培養物中純化獲得10-20mg具有生物活性的蛋白。SpectraMax Paradigm平臺使用AlphaLISA方法可以定量低至pmol級的蛋白（圖1）。使用軟件內置的經過優化的檢測程序，可以在2分鐘內完成384孔板的檢測。
然后，我們開發出一個AlphaLISA分析方法，用于檢測內皮細胞經過TNF-alpha刺激后產生的促炎癥因子的水平。使用上面純化的人重組TNF-alpha蛋白處理人肺微血管內皮細胞（HLMVEC）誘導細胞間粘附因子1（ICAM-1）表達。在孵育處理18小時后ICAM-1被上調表達。使用AlphaLISA對ICAM-1的表達水平進行定量（圖2A）。
內皮細胞經過TNF-alpha或LPS刺激后，表達分泌IL-8。IL-8是一種中性白細胞的趨化蛋白，而中性白細胞可以在體內浸潤發炎的組織。因此，對內皮細胞分泌的IL-8進行定量，可以提供很有價值的在體外血管內皮細胞促炎癥反應狀態信息。為了評估分泌的IL-8水平，我們使用AlphaLISA分析了經過處理的HL-MVEC細胞培養上清樣品（圖2B）。
ICAM-1和IL-8在HL-MVEC內表達上調（圖2）
TNF–alpha處理細胞18小時后，使用SpectraMax Paradigm平臺的AlphaLISA方法檢測 HL-MVEC細胞內ICAM-1 (A) 和IL-8 (B) 的上調水平。
基于內皮細胞篩選鑒定抗炎化合物
藍藻是一種藍綠色藻類，它具有非常多樣的代謝產物。其中一些代謝產物具有很好的治療前景，目前正在研究用于治療炎癥疾病。1,2,3我們使用上面描述的方法從藍藻中篩選具有抗炎癥的化合物。HL-MVEC預先使用從Nostoc藍藻中提取的不同組分進行處理，然后使用0.4ng的人TNF-alpha蛋白進行刺激。18個小時后，在SpectraMax Paradigm平臺上使用AlphaLISA技術檢測得到ICAM-1得以上調表達，然后對細胞培養上清進行進一步分析IL-8的水平。我們發現藍藻8721,6組分（圖3）可以顯著降低ICAM-1的產生，顯示出抗炎癥活性。這個組分也明顯降低IL-8的表達分泌（數據未給出）。在進行AlphaLISA檢測前，也對組分進行了細胞毒性檢測，顯示其細胞毒性作用很小，可以忽略。
藍藻中抗炎活性成分的篩選（圖3）
使用AlphaLISA分析藍藻中各組分的ICAM-1上調效應。組分8721,6可以顯著降低ICAM-1的表達生成。
總結
SpectraMax Paradigm平臺聯合AlphaLISA提供了一個強有力的工具，可以使用基于內皮細胞、病理相關的模型篩選新型的治療藥物。高靈敏度、高速度、高達1536孔板的兼容性以及內置的預先優化的檢測程序，使用戶操作更簡單、運行更快速。SpectraMax Paradigm是你使用Alpha技術篩選藥物的最好選擇。
致謝
最后我們要感謝Maren Plüger Anita Eigner、Maria Hirschler、Linda Kotnik、Katrin Fuchslueger、Julia Schweiger、Christoph Wiesner、Andreas Eger、Wolfgang Schütt以及IMC大學的Harald Hundsberger、Czech 科學院的Jiri Kopecky，感謝他們慷慨提供數據。
參考資料
1. Rasool, M.; Sabina, E. P.; Lavanya, B. Biol Pharm Bull 2006,29(12), 2483
2. Romay, C.; Armesto, J.; Remirez, D.; Gonzalez, R.; Ledon, N.; Garcia, I. Inflamm Res 1998, 47(1), 36.[31]
3. Prinsep, M. R.; Thomson, R. A.; West, M. L.; Wylie, B. L. J Nat Prod 1996, 59(8),
