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單細胞腦類器官篩選用于鑒定自閉癥的發育缺陷

瀏覽次數:757 發布日期:2024-9-5  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

文章詳情

文章標題:Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism
中文標題:單細胞腦類器官篩選用于鑒定自閉癥的發育缺陷
期刊:Nature
IF:50.5
研究機構:奧地利科學院分子生物技術研究所(IMBA)
doi: 10.1038/s41586-023-06473-y


01 簡介

人類大腦的發育涉及許多獨特且復雜的過程,這些過程在其他許多物種中都未曾見到。這些過程可能導致神經發育障礙(Neurodevelopmental disorder, NDD),如自閉癥譜系障礙(ASD)。ASD的檢測只能在發育成熟的大腦中實現。腦類器官作為一種類大腦的三維細胞培養系統,提供了在體外研究人類大腦發育的可能性。雖然腦類器官可以用來在人體環境中研究神經發育障礙,但也受到變異性和低通量的限制。本文介紹了一種結合了類器官、基因編輯及單細胞轉錄組技術的新系統,用于研究ASD相關基因對細胞命運決定和發育階段的影響。

研究者開發了CRISPR-human organoids-scRNA-seq(CHOOSE)系統,這個系統結合了CRISPR/Cas9基因編輯技術和單細胞轉錄組技術,用于高效篩選和分析與ASD相關的基因。使用已驗證的gRNA對和可誘導的CRISPR/Cas9系統在類器官中進行基因敲除篩選,可以使類器官中的每個細胞最多攜帶一個特定ASD基因的突變。利用單細胞多組學數據,包括轉錄組和染色質可及性構建類器官的發育基因調控網絡,在單細胞水平上追蹤每個突變的影響。隨后,研究了36個與ASD相關的高風險基因對細胞類型和發育軌跡的影響。


02 技術路線

1、類器官生成
使用人類胚胎干細胞(hESCs)生成類器官,確保類器官中存在豐富的端腦組織。


2、gRNA設計和驗證
針對每個目標基因設計一對引導RNA(gRNA),選擇與自閉癥譜系障礙(ASD)相關的高風險基因。這些基因與轉錄調控和發育過程相關,具有研究價值。


3、構建CRISPR載體
使用誘導型CRISPR/Cas9系統,將gRNA和Cas9基因構建到同一個載體中。這種系統可以通過加入誘導劑(如四環素)激活Cas9的表達,從而控制基因敲除的時間和空間。將CRISPR載體轉染入hESCs,通過抗性篩選和流式細胞術確定成功轉染的細胞克隆。


4、克隆條形碼標記
為每個dual-sgRNA cassette引入克隆條形碼,以標記各個細胞的遺傳操作。這些條形碼在單細胞測序中用于追蹤每個細胞的遺傳背景。通過PCR和測序驗證條形碼的獨特性,確保每個細胞克隆都可以被準確識別來驗證條形碼的獨特性和穩定性。


5、單細胞RNA測序(scRNA-seq)
將類器官解離成單細胞懸液,使用10x Genomics Chromium系統進行單細胞捕獲和cDNA合成。構建單細胞RNA測序文庫,使用Illumina測序平臺進行高通量測序,獲取每個細胞的基因表達數據。


6、數據分析
對單細胞RNA測序數據進行預處理,包括過濾低質量細胞和去除背景噪音。使用聚類分析和標記基因表達水平,鑒定類器官中的不同細胞類型。應用偽時間分析(pseudotime analysis)構建細胞發育軌跡,研究不同基因敲除對細胞分化路徑的影響。結合轉錄組和染色質組數據,構建類器官的發育基因調控網絡,識別ASD相關基因的調控模塊。


7、實驗驗證
在特異性誘導多能干細胞(iPSCs)生成的患病類器官中,驗證關鍵基因(如ARID1B)對細胞命運決定的影響,與未進行基因編輯的類器官進行對照,分析基因敲除的具體效應。


03 實驗結果

img1Figure 1

展示了用于人腦類器官中ASD風險基因篩選的CHOOSE系統。使用了帶有條形碼的雙sgRNA,在多個時間點評估了gRNA的編輯效率和分布。通過UMAP展示了scRNA-seq數據集中的背側和腹側大腦區域軌跡。熱圖展示了不同細胞類型中標志基因的表達,RNA速率分析顯示了發育方向 。
 

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Figure 2

顯示了24個基因干擾下細胞類型豐度的顯著變化。發現大多數基因干擾導致背側-腹側細胞比例的降低。具體基因如KMT2C的干擾導致背側細胞的減少和腹側細胞的增加。某些基因干擾只影響特定細胞類型,例如ADNP、MED13L、ILF2和DDX3X 。

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Figure 3

比較了不同基因干擾條件下的基因表達變化。圖中展示了DEGs(差異表達基因)在不同TF模塊中的富集情況,如MEF2C、BCL11A、SATB2和OLIG1。這些富集的TF模塊與ASD的相關基因有顯著的關聯 。

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Figure 4

描述了一位ARID1B突變患者的腦發育情況。使用SNP分型顯示在6號染色體上的一個微缺失。患者在兩個妊娠階段的GE(LGE和CGE)體積與年齡匹配的對照組的比較。數據表明,ARID1B突變可能導致GE體積的異常增大 。這些圖展示了ASD相關基因在腦類器官中的影響,揭示了基因干擾如何導致特定細胞類型的變化以及這些變化與ASD癥狀的潛在關聯。

04 總結

這項研究開發了一種高效的CHOOSE系統,實現了在類器官中進行大規模基因功能研究的可能性。研究結果表明,ASD高風險基因對大腦類器官的發育有顯著影響,特別是在細胞命運決定和發育階段的調控上。干擾BAF復合物的成員(如ARID1B)會導致腹側端腦祖細胞數量增加,且ARID1B控制祖細胞向少突膠質前體細胞和中間神經元的轉變。這一發現通過患者特異性iPSC衍生的類器官得到了驗證。這項研究為在人類類器官模型中表征疾病易感基因的表型奠定了基礎。

本文創新性地結合了CRISPR基因編輯和單細胞轉錄組學技術,建立了一個強大的篩選系統,揭示了ASD相關基因在大腦發育中的重要作用。研究結果不僅拓展了我們對自閉癥發病機制的理解,還為未來利用類器官模型進行疾病研究和藥物篩選提供了新方法。

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