原創 EFL EngineeringForLife

腹腔栓塞治療腹主動脈瘤（AAAs）在臨床上仍然受到動脈內膜滲漏復發的限制。這些復發與內皮內襯和基質金屬蛋白酶（MMPs）介導的動脈瘤進展導致的再通相關。因此，來自美國川崎生物醫學創新研究所的Menekse Ermis、 Ali Khademhosseini與韓國高麗大學的Han-Jun Kim聯合將一種常見的硬化劑和MMPs抑制劑—多西環素（DOX）結合到一種剪切變薄生物材料（STB）的血管栓塞水凝膠中，DOX的加入有望通過抑制MMP活性、促進內皮清除，同時防止內滲漏。研究結果表明，含有4.5% w/w硅酸鹽納米血小板和0.3%w/vDOX的STB是可注射的，與沒有DOX的相比，存儲模量增加兩倍。與未經治療的血液相比，STB-DOX水凝膠減少33%的凝血時間。在體外豬主動脈模型中，從水凝膠中爆發性釋放的DOX在6小時后顯示出硬化效應。7天后，內皮細胞上的水凝膠持續釋放DOX顯示MMP抑制。該水凝膠成功地阻斷患者來源的腹部動脈瘤模型。多功能STB-DOX水凝膠的硬化和MMP抑制特性可能為有效栓塞血管內的動脈瘤提供很好的機會。

相關研究內容以“Injectable Shear-Thinning Hydrogels with Sclerosing and Matrix Metalloproteinase Modulatory Properties for the Treatment of Vascular Malformations”為題于2023年9月8日發表在《Advanced Functional Materials》。

 
基質金屬蛋白酶（MMP-2和MMP- 9）是一類鋅內肽酶，通過炎癥反應過程中釋放的因子觸發AAAs中細胞外基質（ECM）的分解（圖1A）。多西環素（DOX）是一種四環素抗生素，用于抑制基質金屬蛋白酶和內皮剝脫。局部注射DOX可引起內皮損傷，導致局部止血，使其閉塞。因此，在血管內動脈瘤修復（EVAR）的內滲漏治療中，通過內皮剝脫和MMP抑制，局部輸送到動脈瘤部位有效緩解主動脈擴張（圖1B）。
 
SNs的表面電荷分布為各向異性，具有正面和負面（圖2A）。為了證實DOX添加劑對水凝膠凈電荷的影響，測量水凝膠的zeta電位（圖2B），結果表明，SNs的表面負電荷為−25mV，而DOX的表面正電荷為+19 mV。在SNs中引入DOX導致DOX的zeta電位顯著降低，表明這兩個部分之間可能存在靜電相互作用。所有水凝膠粘度都隨著剪切速率增加而降低（圖2C）。圖2D顯示在包含高應變（100%）和低應變（0.01%）的交替循環的時間掃描中，剪切變薄和流變恢復的影響，在較大的應變振幅下，STB-DOX 0.5%和STB-DOX 1%明顯軟于Gel-SN。在較大的應變振幅下，Gel-SN-DOX 0.3的斷裂網絡明顯軟于Gel-SN（圖2E-G），表明更容易注射。通過掃描電鏡對凍干水凝膠的微觀結構特性進行表征（圖2H），在沒有DOX的情況下，STB凝膠的孔隙大小表現出明顯的異質性，分布范圍為20~150μm。當將DOX引入STB凝膠時，孔徑分布變得更加均勻，主要在20~50μm范圍內，這一結果表明，DOX影響STB凝膠的孔隙結構，使孔隙徑分布更加均勻并變窄。
 
使用體外凝血試驗檢測DOX補充劑在Gel-SN平臺上的止血作用（圖3A、B），與未經處理的血液對照組相比，STB和STB-DOX水凝膠顯著減少凝塊形成的時間。采用溶血實驗研究水凝膠的血液相容性。不含DOX和低劑量DOX（0.1%和0.3% w/v）的STB水凝膠顯示溶血百分比低于5%的標準安全極限。而添加0.5% w/v的DOX后，溶血百分比提高到5%以上。因此，0.3% w/v DOX含量的STB-DOX水凝膠為后續優化的合適配方（圖3C、D）。

 
為避免損害周圍的動脈組織，隨著時間的推移，監測水凝膠在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中孵育時的溶脹率（%）（圖4A），結果表明，所有STB條件在前20 min內達到最大腫脹，并在研究的剩余時間內保持平衡。為了檢測復合水凝膠的降解性，將STBs在37°C的PBS中孵育175小時（圖4B）。在PBS中，以37°C檢測STBs中DOX的釋放譜（圖4C），所有配方在6h內均出現爆發性釋放，在72 h內持續釋放，釋放速率逐漸衰減。通過MMP活性對內皮細胞和巨噬細胞活性的影響和細胞毒性進行評估（圖4D、E）。活死染色結果顯示，當DOX濃度增加到0.5% w/v時，死細胞（紅色）的數量多于活細胞（綠色）（圖4F）。因此，根據釋放率、細胞活力和MMP抑制結果，選擇STB-DOX 0.1和0.3組進行下一步評價。

 
如圖5A所示，采用體外臺式試驗檢測Gel-SN-DOX水凝膠在閉塞血流中的效率，根據動脈瘤的典型大小，采用特定的設計在體外復制動脈內膜滲漏。水凝膠注射的各個階段和腰椎動脈同時發生的血流變化如圖5B所示，系統內的血流循環設置為支架插入后動脈瘤模型達到約15-20 mL min−1，對應實際動脈瘤內滲漏流量。圖5C比較了不同配方的栓塞成功率。相比于其他組，STB-DOX 0.3水凝膠有更高的栓塞成功率。

 
通過分析CD31、VE-鈣粘蛋白、ZO-1、血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）和Von血友病因子（VWF）等蛋白的表達，深入了解STB-DOX治療對內皮細胞功能、血管生成和止血的潛在影響（圖6）。為了研究這些治療方法對血管結構完整性的影響，使用ImageJ軟件進一步定量CD31陽性細胞上VE-鈣粘蛋白的表達的表達（圖6Aa、Ba)。接下來研究STB-DOX處理對CD31陽性HUVECs中ZO-1表達的影響（圖6Ac、Bc）。STB-DOX濃度的增加下調HUVECs中VEGFR2的表達（圖6Ab、Bb），表明該信號通路受到損害。綜上所述，本研究結果表明，STB-DOX治療可能會對HUVECs中這些關鍵蛋白的表達和活性產生不良影響，從而影響血管的健康和功能。

 
栓塞6h后固定樣本，切片并染色以進行內皮覆蓋（圖7A）。未經處理的主動脈切片的HE染色顯示內皮細胞層在動脈的管腔側，中膜上方觀察到（圖7B 藍色*）。在用HE染色的載玻片初步觀察內皮細胞消融后，對這些切片進行免疫組化（圖7C）。切片染色內皮標記物CD31，吞噬素染色細胞骨架，DAPI染色細胞核。在未治療的主動脈切片中可見兩層主動脈壁，內膜和中膜。通過STB-DOX配方（STB-DOX 0.1、STBDOX 0.3和STB-DOX 0.5組），觀察到隨著DOX濃度的增加，綠色信號逐漸減少，表明內皮層的去除。

總之，本研究提出一種使用STBs和DOX治療腹主動脈瘤的新方法。將DOX加入到由明膠和硅酸鹽納米血小板組成的可注射物理水凝膠中，可達到內皮消融和基質金屬蛋白酶抑制的雙重目的，隨后的緩釋階段有利于保留對基質金屬蛋白酶的抑制。STB-DOX水凝膠表現出強大的力學性能，并能在生理壓力下阻塞管狀結構。該水凝膠還能有效地抑制基質金屬蛋白酶，促進硬化作用，并在生理血壓和血流速率下成功地阻斷患者來源的動脈瘤囊模型。本研究還發現，STB-DOX治療影響參與維持內皮細胞功能、血管生成和止血的幾個關鍵蛋白的表達，包括CD31、VE-鈣粘蛋白、ZO-1、VEGFR2和VWF。這些結果表明，這些可注射的的水凝膠在血管和腹主動脈瘤栓塞方面具有巨大的潛力。未來的研究可以擴大這些水凝膠在其他應用中的潛力，并優化其成分和性能以適應其他醫療條件。總的來說，這些結合DOX的可注射性水凝膠的發展代表靶向治療血管疾病的一個有前途的進展。



文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202305880