NAT COMMUN | 衰老退化為哪般？蛋白質組學（TMT+label-free）破譯衰老密碼
 

眾所周知，干細胞的老化被認為是導致組織和器官老化的根本原因，尤其是在高周轉率的生物系統中，比如造血作用。隨著干細胞的老化，受損組織被替換的潛能也會隨之減弱，在人體中，貧血，適應性免疫系統能力的下降，以淋巴細胞為代價的骨髓細胞的擴張，以及頻發的血液系統惡性腫瘤，這些都已經被報道與衰老息息相關。但是這些變化的機制仍然難以捉摸。2018年新發表于NATURE COMMUNICATIONS上的來自歐洲分子生物學實驗室的科學家們就關注該方向，這項研究的首要目的就是利用TMT和labelfree技術對人類hpc細胞以及骨髓壁龕中的細胞群老化過程進行研究，從而揭秘衰老的分子機制。

文獻來源

https://www.onacademic.com/detail/journal_1000040868031610_5093.html   IF=12.353

研究材料

59例年齡在20到60歲之間的志愿者，對通過髂后嵴穿刺得到的細胞進行分離，得到HPC細胞，和其它5種與骨髓壁龕相關的細胞：LYM（淋巴細胞和前體），MON（單核細胞/巨噬細胞和前體），GRA（粒細胞前體），ERP（紅細胞前體），MSC（間充質干細胞/wd基質細胞）。

技術方法

TMT標記定量蛋白質組和label free分級非標記定量蛋白質組學（如下圖）。轉錄組學研究提供了潛在分子機制的藍圖，并指出與年輕的HPCs相比，老化HPC中與細胞周期，骨髓譜系規范以及髓樣惡性腫瘤相關的基因上調。基于TMT的定量方法，準確測定同一細胞群內衰老過程中的變化，而利用 label free(LF)的方法來評估不同細胞群之間的蛋白質豐度。這也是本文的一個創新點，利用2種定量組學來分別分析細胞群內和細胞群之間的蛋白水平的變化。文章還結合Single-cellRNA-sequencing法對HPCs進行了單細胞測序，檢測了蛋白組中顯著變化的蛋白的相關轉錄水平的變化。

結果分析

1. 鑒定到蛋白的結果展示

對分離得到的6種細胞分別進行label free和TMT定量分析，總共鑒定到12158中蛋白，并展示了6種細胞的鑒定數量及其之間的重疊性。

2. 對label free得到的數據進行聚類分析，結合斯皮爾曼相關系數，得到結果如下圖b，可以看出常見表達的蛋白質的表達能夠用區分6個不同的細胞群，這可能反映了不同的細胞系對譜系定向的特定代謝需求以及對細胞特定過程和功能的適應。為了了解不同細胞群中通路的豐度是否不同，作者對LF數據基于Reactome數據庫進行了通路分析，下圖C是通路結果的展示，通過數據整合分析發現一些主要的蛋白都涉及了糖酵解通路。

3. 年齡對蛋白組的影響

為了研究年齡增加與蛋白組變化之間的關系，作者對TMT數據進行Spearman's相關性分析，并基于Reactome數據庫進行通路分析，這一分析揭示了蛋白質豐度中細胞類型特異性和年齡相關性的顯著變化，如上圖a顯示了基于每個細胞群體中五個最高上調和下調的途徑所篩選到的109個通路。作者還找到了一些已報道的老化標志物的變化，比如說，在老化的HPC細胞中，IRF8和DNMT1這兩個都會減少。

4. 在HPC細胞中年齡影響碳代謝

通過分析，作者發現年齡引起的HPC細胞最值得關注的變化就是酶的變化，這些酶在在糖酵解，糖原分解代謝，以及脂肪酸β氧化中扮演很重要的角色。中心碳循環在衰老中發生了顯著變化，圖a描述了HCP細胞的葡萄糖代謝和TCA循環，箭頭代表但單向反應，筆畫代表雙向反應，不同的顏色代表不同的表達情況，黑色代表該酶不隨年齡變化，紅色和藍色分別代表顯著上調和下調的酶。最終發現有17種蛋白在糖酵解和TCA循環通路中發生了顯著的變化（可以考慮深入研究一下代謝組學數據）。

5. 衰老時髓樣與淋巴分化的比較

另外，作者還發現，隨著年齡的增長，骨髓細胞與淋巴細胞的分化程度更高。在HPC群中明確發現的17種蛋白，它們參與維持多能性，或者沿著髓系或淋巴系分化。為了描述HPCs與年齡相關的功能衰減，作者隨后檢測了這些蛋白的豐度隨年齡的變化動態，發現與淋巴樣發育和功能直接相關的2個蛋白（DNTT and BCL11A）隨著HPCs老化顯著減少，相反的，下游信號效應物GUCY1A3and GUCY1B3，隨著HPCs老化顯著增加，一氧化氮——環鳥苷酸通路信號傳導已被證明可以調節造血作用，也可能表明分化傾向于髓系。

為了檢查糖酵解途徑的準備階段中酶豐度的增加是否可能是CD34 +細胞譜系偏向骨髓分化的直接后果，作者分析了自年輕人（n = 2）和老人（n = 2）受試者的519個單細胞分選的HPCs的轉錄組結果。基于淋巴或髓樣分化的信使RNA（mRNA）標記的豐度水平，對每個單獨的HPC細胞進行分類（圖c）。結果發現，骨髓引發的HPCs中年齡增加的糖酵解酶的mRNA水平高于淋巴引發的，而未受年齡影響的酶的轉錄物在兩個子集中保持相似的水平。

6. 與HPCs有關的骨髓壁龕的變化

由細胞微環境產生的幾個負責HPCs的歸巢和外出必要因子和粘附分子，在MSCs老化時豐度都有所下降，而基質細胞衍生因子- 1（SDF-1/CXCL12），血管細胞粘附分子1（VCAM1）以及纖連蛋白（FN1）在MSCs老化時豐度都發生了增強。這些變化表明，衰老與ECM的重組以及骨髓壁龕架構的結構變化有關。

小結

這篇文章主要是通過經典的TMT和label-free的高通量組學，結合單細胞測序研究衰老過程中HPC細胞群分化與功能衰退以及對骨髓分化的偏向，且深入分析了不同的年齡表型與功能表現差異，從而揭示出衰老引起骨髓壁龕的變化，同時會引起HPC歸巢涉及通路的功能的衰退，為探索衰老機制提供了強有力的理論依據，也會后期的研究提供了研究思路和方向。

蛋白|修飾|代謝|脂質|結構確證

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