一．Cre-loxP重組系統(tǒng)作用原理

• Cre重組酶和loxP位點

Cre重組酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，是由343個氨基酸組成的38kD的蛋白質(zhì)。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能夠特異性識別loxP位點。

LoxP（locus of X-overP1）位點長為34bp，包括兩個13bp的反向重復(fù)序列和一個8bp的間隔區(qū)域。其中，反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區(qū)域決定了loxP位點的方向。

 

 

                         圖1. Cre重組酶和loxP位點

（http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design）

 

• Cre-loxP重組系統(tǒng)誘導(dǎo)基因重組的方式

Cre-loxP系統(tǒng)存在幾種誘導(dǎo)重組的方式，這是基于Cre重組酶與loxP位點的相互作用而實現(xiàn)的。

當(dāng)基因組內(nèi)存在loxP位點時，一旦有Cre重組酶，便會結(jié)合到loxP位點兩端的反向重復(fù)序列區(qū)形成二聚體。此二聚體與其他loxP位點的二聚體結(jié)合，進而形成四聚體。隨后，loxP位點之間的DNA被Cre重組酶切下，切口在DNA連接酶的作用下重新連接。重組的結(jié)果取決于loxP位點的位置和方向。主要存在幾下幾種重組方式：

• 兩個loxP位點位于同一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶敲除loxP間的序列；
• 兩個loxP位點位于同一條DNA鏈上且方向相反，Cre重組酶誘導(dǎo)loxP間的序列翻轉(zhuǎn)；
• 兩個loxP位點位于不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶誘導(dǎo)兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位；
• 四個loxP位點分別位于兩條DNA鏈或染色體上，Cre重組酶誘導(dǎo)loxP間的序列互換。

 

 

圖2. Cre-loxP誘導(dǎo)基因重組的方式

（https:///search/rolling%20circle%20replication）

 

二．維真 Cre-loxP重組系統(tǒng)的AAV載體構(gòu)建和病毒包裝服務(wù)

Cre-loxP重組系統(tǒng)AAV載體
Cre-loxP重組系統(tǒng) 腺相關(guān)病毒	Cre重組酶誘導(dǎo)表達的FLEX-ON系統(tǒng)
	Cre重組酶反式剪接系統(tǒng)

 

• 依賴Cre重組酶誘導(dǎo)表達的FLEX-ON系統(tǒng)

結(jié)合組織特異性的啟動子和不同的AAV血清型， FLEX-ON系統(tǒng)能完成更精準的組織特異性控制和時間控制。

在FLEX-ON系統(tǒng)中，目的基因反方向位于啟動子下方，兩側(cè)分別連接兩個“頭對頭”的loxP。Cre重組酶不存在時，目的基因不能表達；當(dāng)Cre重組酶存在時，可以誘導(dǎo)目的基因的“翻轉(zhuǎn)”，從而表達。

 

圖3.維真提供依賴Cre的FLEX-ON系統(tǒng)示意圖

 

圖4. 維真的FLEX-ON實驗圖

 

• 依賴Cre重組酶反式剪接系統(tǒng)——輕松擁有“表達大基因的AAV”

較小的包裝能力（小于5kb）使得AAV應(yīng)用受到限制。維真為您提供依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)，讓您輕松擁有“表達大基因的AAV”。

多個重組AAV的共轉(zhuǎn)染效率高達90%，維真將較大基因分為兩部分構(gòu)建于兩個AAV載體上。通過ITR的重組、mRNA剪接和Cre-loxP消除ITR的對轉(zhuǎn)錄的抑制作用，實現(xiàn)目的蛋白的表達。相比于單個載體維真提供的依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)的表達效率約20%。

圖5. 維真提供依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)示意圖

 

 

圖6. 維真的依賴Cre的反式剪接系統(tǒng)實驗圖

 

三．維真 Cre-loxP 重組系統(tǒng)AAV操作方法

（一）體外實驗

以2型AAV病毒為例，維真為您推薦的MOI值10⁴-10⁵，是根HEK293細胞得出的數(shù)據(jù)，不同的細胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議您感染目的細胞前，進行預(yù)實驗摸索最佳MOI值，推薦使用有熒光的對照病毒來摸索條件。

1. 為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進行預(yù)實驗。

2. 將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%為最佳。為保證細胞生長良好，請保證細胞貼壁過夜。

3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培養(yǎng)基中做1:10稀釋（10^-1），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10^-7。可根據(jù)實際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

 

4. 取出提前準備好的96孔板，先確定細胞生長狀況是否良好。用準備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)基，注意保留未加入病毒的細胞孔作為對照組。

 

5. 在加入病毒稀釋液后，請在12-24h后觀察細胞狀態(tài)來確認加入的病毒量是否合適，是否因為加入的病毒量影響細胞狀態(tài)。如果細胞沒有變化，即所加病毒對細胞沒有毒性，可以繼續(xù)培養(yǎng)。

 

6. AAV病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后每天觀察細胞中熒光表達情況。

 

另：如果您選擇的產(chǎn)品沒有熒光標簽請在96小時以后的不同時間段分別收獲細胞并通過Western-Blot或其他檢測手段來檢測基因表達。

注：由于AAV組織特異性，體外感染細胞的效率比較低，所以我們強烈推薦您購買AAV用于動物實驗。

（二）體內(nèi)實驗

針對小鼠/大鼠來說，研究不同的方向有不同的AAV注射方法，詳情可查閱維真官網(wǎng)。

 

 

 

四．常見問題解答

1.重組AAV 安全嗎?

迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。

2.哪些血清型的 AAV 可供選擇？我該選用哪種AAV呢?

目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 &  AAV9。請參閱下面指南中參考文獻的建議。

 

AAV Serotype	Muscle	Hepatocyte	Pulmonary	Brain	Retinal pigmented epithelium	Pancreas	Kidney
AAV1	X			neuons and glial cells	X	X
AAV2							X
AAV5			lung alveolar cells	neuons and glial cells	X
AAV6	X		X
AAV7	X			neurons	X
AAV8	X	X		neurons	X	X
AAV9	X	X	X		X	X	X

 

請同時參閱轉(zhuǎn)染效率與不同細胞類型對照表，以確定哪種血清型AAV更適合您的細胞。

3.使用重組腺相關(guān)病毒rAAV傳遞基因的優(yōu)勢是什么?

rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂細胞、免疫原性極小、體內(nèi)表達外源基因時間長。

4.AAV 載體穩(wěn)定嗎? 如何保存AAV載體?  

純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩(wěn)定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。

5.訂制AAV服務(wù)，客戶需要提供哪些材料? &客戶收到的產(chǎn)品是怎樣的?

您可以從我們的人源全長cDNA庫(17,000預(yù)制ORF)中挑選，或者提供您的質(zhì)粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標簽和AAV血清型。

基因沉默服務(wù)，請您提供確切的shRNA的序列以構(gòu)建重組rAAV載體。我們的標準載體具有U6啟動子和GFP標記。

通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根據(jù)客戶的需要，提供特定體積和滴度的產(chǎn)品。