動物總RNA的提取與電泳

I．  實驗目的與要求
A.   理解和掌握提取和純化動物總RNA的技術原理和操作方法。
B.   理解和掌握通過電泳鑒定提取所得的動物總RNA的技術原理和操作方法。
 
II． 實驗原理和背景知識
A.   RNA是生命活動中基因表達過程非常重要的生物大分子，如mRNA,它攜帶了DNA的全部編碼信息。RNA的分離是研究基因功能的重要基礎之一，在分子生物學中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern blot、RT-PCR、構建 cDNA文庫、Gene Chips以及體外翻譯等實驗。
B.   本次試驗中，由于RNase極穩定，所以，在操作RNA時，要格外仔細，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必須對所用器皿進行RNase滅活處理。如用180oC干烤8小時以上處理玻璃器皿，或用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相關的緩沖液也需要用0.1% DEPC水處理，但Tris-Cl緩沖液等不可以用DEPC處理。（注意：DEPC有致癌之嫌 ，必須小心操作，防止接觸與吸入 ！）
C.   在動物細胞內，所含RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。rRNA含量最豐富，由28S、18S和5S幾類組成。mRNA種類繁多，分子量從數百至數千堿基不等，但絕大多數mRNA在3’端都有一個Poly-A尾巴，因此，可根據此特性用寡聚脫氧胸苷(Oligo dT)層析柱從總RNA中將 mRNA分離出來。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northern blot試驗。
D.   提取動物RNA的實驗操作中要注意的問題有以下幾點：
1.一般用機械研磨或勻漿的方法破碎動物組織細胞；
2.要加入蛋白質變性劑，使核蛋白與RNA分離并釋放出RNA；
3.抑制內源和外源RNase活性；
4.將RNA與DNA、蛋白質及其它細胞成分分開。
E.   總體而言，目前在實驗中應用較多，較為成熟的提取總RNA的方法有3種:
1.    苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；
2.    胍鹽法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和b-巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經氯仿抽提后再沉淀；
3.    氯化鋰沉淀法：因為鋰在在一定pH下能使RNA相對特異地沉淀，但容易使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對mRNA有抑制作用。
F.   在本次實驗中，RNA提取過程采用的是Invitrogen公司的TRIzol試劑，其原理是依據胍鹽法。即在含有強的異硫氰酸胍變性劑的提取液中裂解動物組織粉末，在提取緩沖液中含有RNase抑制劑，抑制RNase活性，保證RNA的完整性。樣品在TRIzol 試劑中能夠充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會形成上清層、中間層和有機層（下層），RNA分布在上清層中，收集上清層后，經異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。
G.    所提取動物總RNA的電泳和檢測：
RNA的檢測主要用瓊脂糖凝膠電泳，分為非變性電泳和變性電泳。一般變性電泳用的最多是甲醛變性電泳（如Northern blot 實驗過程中）。
由于RNA分子是單鏈核酸分子，它不同于DNA的雙鏈分子結構，其自身可以回折形成發卡式二級結構及更復雜的分子狀態，以至通過一般傳統的瓊脂塘凝膠電泳難以得到依賴于分子量的電泳分離條帶，為此電泳上樣前將樣品于65攝氏度加熱變性5分鐘，使RNA分子的二級結構充分打開，并且在瓊脂糖凝膠中加入適量的甲醛，可保證RNA分子在電泳過程中持續保持單鏈狀態，因此，總RAN樣品便在統一構像下得到了瓊脂糖凝膠上的依賴于分子量的逐級分離條帶。而且RNA變性后有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜的結合。RNA通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，可以直觀快捷的分析RNA質量之優劣，當有標準的“分子標尺”（marker）存在時，還可相對客觀的對總RNA樣品進行定性和定量。為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將凝膠切下，上色、拍照。

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