銳賽小課堂1222-158

一、貼壁細胞蛋白提取

A

1..將水浴鍋的溫度調至100℃，等水浴鍋達到100℃溫度后，取出需要收樣的細胞的培養皿或者孔板。

2.將緩沖液（1Xloading buffer）置于100℃水浴鍋中預熱10min。

（loding buffer： 是5Xloding buffer用純水稀釋到1Xlodingbuffer。廠家：碧云天；貨號： P0015L）

3.棄去細胞培養基，用PBS洗兩遍。

4.取預熱好的緩沖液1X loding加入到去除細胞培養液的細胞中，用細胞刮將細胞掛下收集到EP管。

（加入loding buffer的體積建議量，以細胞密度長到70%-80%，6孔板每孔加入120ul；150px皿200ul；250px皿300ul）

5.將收集好的細胞液轉移到EP管中，立即放入100℃煮15min。

6.

B

1.倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將 PBS 棄凈后把培養瓶置于冰上。

3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）

4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。

5.裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）

6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機預冷）

7.將離心后的上清分裝轉移倒 0.5 min 的離心管中放于-20℃ 保存。

（個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶 50 ml 的細胞有時按照實驗要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。本人是先用預冷的 PBS（一般數毫升）加入后，用細胞刮刮下細胞，轉移至試管中，如果數瓶細胞是收集同一蛋白的，可以放在同一試管，離心后再將蛋白轉移到 EP 管中，這樣可操作性就比較強）

二、組織中總蛋白的提取：

1.將少量組織塊置于 1～2 ml 勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

2.加 400 μ 單去污劑裂解液裂（含 PMSF）于勻漿器中進行勻漿。然后置于冰上。

3.幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。

4.裂解 30 min 后，即可用移液器將裂解液移至 1.5 ml 離心管中，然后在 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于-20℃ 保存。

三、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：

由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：

1.將培養液倒至 15 ml 離心管中，于 2500rpm 離心 5 min。

2.棄上清，加入 4 ml PBS 并用槍輕輕吹打洗滌，然后 2500rpm 離心 5 min。棄上清后用 PBS 重復洗滌一次。

3.用槍洗干上清后，加 100 μ 裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。

4.將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起 4℃.12000rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于-20℃ 保存。

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