瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)DNA
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動(dòng)。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA， 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如質(zhì)粒有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circμLar DNA，簡稱 CCCDNA)；開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1條鏈斷裂，（open circμLar DNA， 簡稱OCDNA）；線狀質(zhì)粒DNA ，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 2條鏈發(fā)生斷裂，（linear DNA，簡稱L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA和開環(huán)質(zhì)粒DNA。
三、主要試劑
瓊脂糖、溴酚藍(lán)、TE、TAE、EB、DNA marker.
1. 10 x TAE (10倍體積的TAE儲(chǔ)存液)
配 1000mL 50 ×TAE：Tris 242g，冰乙酸57.1mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL pH8.0
2. 凝膠加樣緩沖液（6×）：溴酚藍(lán)0.25％，蔗糖40％
3. 瓊脂糖（1%）：稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的電泳板上。
4. 溴化乙錠溶液 (EB) 0.5 μg /mL，置棕色瓶避光保存。
四、儀器耗材
電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠：稱取0.1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入10mL 1×TAE緩沖液，至微波爐加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1％的瓊脂糖凝膠液。
2. 膠板的制備：取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈晾干。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。
3. 將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。加入電泳緩沖液至電泳槽中。
4. 加樣：將樣品5μL與上樣緩沖液1μL混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。同時(shí)加入DNA marker作為對(duì)照。
5. 電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5 V/cm。 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。
6. 染色：將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液（0.5mg/mL）中，染色10min（戴手套操作）。
7. 觀察：在紫外燈下觀察凝膠中的條帶（戴手套操作），并記錄拍照。
8. 有EB的凝膠要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境（戴手套操作）。
六、注意事項(xiàng)
1．EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
2．當(dāng)EB太多，膠染色過深，DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡后再觀察。
3．電泳時(shí)注意導(dǎo)線正負(fù)極，防止接反。
思考題：
瓊脂糖凝膠電泳中DNA 分子遷移率受哪些因素的影響？
通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動(dòng)。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA， 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如質(zhì)粒有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circμLar DNA，簡稱 CCCDNA)；開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1條鏈斷裂，（open circμLar DNA， 簡稱OCDNA）；線狀質(zhì)粒DNA ，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 2條鏈發(fā)生斷裂，（linear DNA，簡稱L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA和開環(huán)質(zhì)粒DNA。
三、主要試劑
瓊脂糖、溴酚藍(lán)、TE、TAE、EB、DNA marker.
1. 10 x TAE (10倍體積的TAE儲(chǔ)存液)
配 1000mL 50 ×TAE：Tris 242g，冰乙酸57.1mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL pH8.0
2. 凝膠加樣緩沖液（6×）：溴酚藍(lán)0.25％，蔗糖40％
3. 瓊脂糖（1%）：稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的電泳板上。
4. 溴化乙錠溶液 (EB) 0.5 μg /mL，置棕色瓶避光保存。
四、儀器耗材
電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠：稱取0.1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入10mL 1×TAE緩沖液，至微波爐加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1％的瓊脂糖凝膠液。
2. 膠板的制備：取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈晾干。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。
3. 將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。加入電泳緩沖液至電泳槽中。
4. 加樣：將樣品5μL與上樣緩沖液1μL混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。同時(shí)加入DNA marker作為對(duì)照。
5. 電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5 V/cm。 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。
6. 染色：將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液（0.5mg/mL）中，染色10min（戴手套操作）。
7. 觀察：在紫外燈下觀察凝膠中的條帶（戴手套操作），并記錄拍照。
8. 有EB的凝膠要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境（戴手套操作）。
六、注意事項(xiàng)
1．EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
2．當(dāng)EB太多，膠染色過深，DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡后再觀察。
3．電泳時(shí)注意導(dǎo)線正負(fù)極，防止接反。
思考題：
瓊脂糖凝膠電泳中DNA 分子遷移率受哪些因素的影響？
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