DAP-seq技術在ABA信號調控水稻適應非生物脅迫機制研究中的應用
近日，中科院植物所王雷研究組在Plant Physiology期刊上發表了題為“Rice CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 transcriptionally regulates ABA signaling to confer multiple abiotic stress tolerance”的研究成果。該研究揭示了OsCCA1調控水稻適應鹽脅迫、干旱脅迫以及滲透脅迫的分子機制。其中，該研究使用了DNA親和純化測序技術（DAP-seq，DNA Affinity Purification Sequencing），鑒定了水稻生物鐘核心組分OsCCA1（Oryza sativa CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）調控的下游靶基因。
研究背景
生物鐘組分和脫落酸（Abscisic Acid，ABA）在調控植物生長發育和適應逆境脅迫過程中具有重要作用，但生物鐘組分是否參與ABA信號轉導，目前還不清楚。
研究材料
野生型水稻材料Dongjin（DJ）和OsCCA1功能缺失的突變體水稻（oscca1-L1和oscca1-L2）
研究結果
圖1. 使用DAP-seq方法，在全基因組水平上鑒定OsCCA1的直接結合靶點。
A. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關聯的基因數量及在全基因組的分布圖。
B. 使用MEME-CHIP分析OsCCA1結合的motif。
C和D. 使用EMSA驗證OsCCA1與SRZ1基因和OsPP2C09基因啟動子區的AAATATC motif的結合。
E. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關聯基因KEGG富集結果。
圖2. 使用RNA-seq發現OsCCA1調節ABA響應基因的表達。
A. oscca1-L1突變體與Dongjin (DJ)相比，上調和下調基因的數量。
B. 鹽脅迫條件下oscca1-L1中DEGs富集最多的15個GO term。
C. oscca1-L1突變體中DEGs與ABA響應基因重疊的基因數量。紅色和藍色箭頭分別表示上調和下調的基因。
D. 熱圖顯示（C）中19個ABA響應基因的轉錄豐度。
E. 鹽脅迫下oscca1-L1中的DEGs重疊的OsPYLs基因（左）、A類OsPP2Cs基因（中）、SnRKs/SAPKs基因（右）。紅色和藍色箭頭分別代表表達上調和下調的基因。
圖3. OsCCA1直接調控ABA響應基因的表達。
A. 比較DAP-seq鑒定的靶基因與RNA-seq結果中，oscca1突變體中已鑒定的DEGs，將重合的基因作為OsCCA1的直接靶基因。
B. OsCCA1靶基因的前15個富集的GO term。
C. OsCCA1直接激活的靶基因與A類OsPP2C基因重疊的基因。oscca1突變體與DJ中5個重疊基因的轉錄豐度。
D. 通過DAP-seq檢測的OsCCA1在OsPP108p（-2625 bp）上結合峰（重復1和重復2）和陰性對照（mock）。
E. OsbZIP46是OsCCA1的靶基因，而且是OsCCA1突變體中下調基因和鹽脅迫反應基因中唯一的基因。
F. 通過DAP-seq檢測到的OsCCA1在OsbZIP46（-1263 bp）上結合峰(重復1和重復2)和陰性對照（mock）。
圖4. OsCCA1直接結合OsPP108和OsbZIP46的啟動子，并激活其轉錄。
A. 在正常條件和NaCl處理24小時后，Dongjin (DJ)和oscca1-Ls植株中OsPP108(左)和OsbZIP46(右)的轉錄水平。
B. 水稻原生質體瞬時表達實驗表明，OsCCA1可激活OsPP108和OsbZIP46的轉錄活性。
C和D. ChIP-qPCR檢測顯示OsCCA1結合OsPP108和OsbZIP46的啟動子。
E和F. EMSA結果顯示OsCCA1直接結合OsPP108和OsbZIP46啟動子的rCBS基序。
結論
本研究使用DAP-seq和RNA-seq方法，揭示了水稻生物鐘核心組分OsCCA1通過直接結合和調控OsPP2Cs和OsbZIP46基因來協調ABA信號網絡增強水稻對多種非生物脅迫適應性的分子機制。該研究為生物鐘調控水稻耐逆性提供了新的理論依據，為研發具有多重抗逆性的水稻品種提供了設計育種的靶點和優質遺傳資源。
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