前幾期，我們已經了解了腫瘤細胞的基本特征及培養手法等，接下來我們將會陸續為大家介紹各種常用的細胞實驗技術。對于任何研究，一套系統的邏輯思路似乎比具體實驗方法更重要。所以在介紹之前，我們就從藥物研發的角度，和大家一起簡單聊聊前人們的研究思路以及腫瘤學研究中一些常用方法與技術，歡迎互相討論。
第一部分:以NCI為代表的藥物篩選模式

該篩選模式即NCI基于NCI-60的抗腫瘤藥物篩選模式，自1990年起，業界和學術界利用NCI-60細胞已篩選出10萬余種化合物，這一方法也是目前腫瘤藥物發現領域的中流砥柱。

首先看看它經歷的4個發展階段：

• 1955-1985年：體內篩選模型（in vivo）。以移植性腫瘤動物模型為基礎，以動物生命延長率和腫瘤生長抑制率為藥物基本評價指標；

• 1985-1990年：體外篩選模型（in vitro）逐漸取代體內模型。即放棄體內小鼠篩選，以人腫瘤細胞株為基礎的體外抗腫瘤藥物篩選模型。

• 1990-2016年：體外篩選模型（in vitro）為基礎。主要是以9大類60種人類腫瘤細胞株NCI-60進行體外篩選；后續在動物體內驗證[1]；

• 2016年-至今：開始使用來自病人的異種移植腫瘤（PDX）為模型。主要是考慮到NCI-60在體外培養已上千代，可能已產生變異。

然而，PDX模型的建立較為困難且數據庫尚不完善，目前我們仍采取以體外細胞株篩選為基礎，體內模型后續驗證的策略。

基本篩選模型如下圖所示：

基于NCI-60的藥物篩選流程[1]

篩藥流程（基于細胞表型篩選）：

1. 首先對待篩化合物初篩（3株較敏感的腫瘤細胞株MCF-7; NCI-H460; SF-268），以抑制細胞增殖為指標（3個參數：半生長抑制GI50，總體生長抑制TGI和半致死濃度LC50）。

2. 進一步在15-20株腫瘤細胞株（包括耐藥細胞株如MCF-7/ADR），正常細胞株等篩選；

3. 綜合體外結果，在體內模型驗證；

4. 藥物安全性、藥代動力學等研究（體內動物水平）；

5. 根據細胞表型獲取相關分子，進行藥物作用機制及靶點探究（體外細胞水平為主）。

根據以上NCI篩選模式的發展階段，我們可以看到以細胞篩選為基礎的模式已逐漸成為了必不可少的部分。

細胞篩選模型的主要優勢：

• 成本低，操作簡單，得到結果快；

• 用藥量少，特別是針對取材困難的天然產物；

• 多種人源細胞株同時篩選，可能篩選出對特殊人類腫瘤有效的藥物。

細胞實驗能得到什么？

• 高通量篩選出候選化合物；

• 初步了解候選化合物的抗瘤譜；

• 為隨后進行的體內實驗提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等 。

常見的細胞實驗技術

NCI-60這種篩選模式主要針對未知靶點的藥物，一般是基于表型的篩選方法（細胞增殖為主），若是發現藥物有較好的抑制細胞生長、轉移或血管新生的作用，即可進一步結合動物體內結果驗證藥效。進而再探索藥物的作用靶點[2]。

如鉑類抗腫瘤藥物，代表藥物：順鉑和奧沙利鉑

• 首先是發現鉑類有很好的抑制多株腫瘤細胞增殖的功能；

• 進一步體內驗證有很好的抗多種癌的效果；

• 最后，發現順鉑與DNA結合干擾了正常分裂而殺死癌細胞；進而通過NMR廣譜分析單晶的X射線衍射技術確定了鉑與DNA堿基結合的位置。

如下圖所示，為未知靶點藥物的篩選過程：

第二部分:新興靶向藥物篩選模式

傳統的抗癌藥物即廣譜的化療藥物除了殺傷癌細胞，也會對正常細胞產生影響，如鉑類藥物具有強烈的腎毒性。因此，21世紀初推動了靶向藥物的發展。這類化合物一般是針對某種已知靶點合成可能與靶點結合或者抑制該靶點的化合物，其中以細胞信號轉導分子為靶點的抗腫瘤藥物占據了大部分：

• 蛋白酪氨激酶抑制劑  代表藥物：依馬替尼

• EGFR酪氨酸激酶抑制劑  代表藥物：吉非替尼 

• 腫瘤新生血管生成抑制藥物 代表藥物：Avastin

• 法尼基轉移酶抑制劑  代表藥物：替匹法尼

• 組蛋白去乙酰化酶HDACs抑制劑  代表藥物：SAHA(臨床階段)

• GPCR  代表藥物：乳腺癌藥物Zoladex

對于這類化合物，一般是先進行靶點驗證如酶活實驗（明確沒有脫靶），再進行細胞相關功能試驗，和體內效果驗證。與未知靶點藥物相比，靶向藥物在靶向探索部分，更加快捷和準確，可以直接進行靶點驗證。

一般篩選過程如下圖所示：

靶向藥物篩選流程

如下圖為HDACs抑制劑的篩選過程，首先在細胞上驗證藥物的靶向性，在確定藥物的靶點后，進行靶點相關的細胞功能試驗，如HDACs與腫瘤細胞生長和分化密切相關，可進行細胞增殖，細胞周期等實驗；最后在動物水平驗證化合物的抗癌效果。

HDACs抑制劑的篩選過程[3]

本期介紹就到這里了，腫瘤細胞學研究是一個很龐大的工程，今天我們只是從新藥研發角度簡單介紹了一些常見的細胞生物學上的實驗方法，希望大家能給大家帶來幫助。

參考文獻

1. Shoemaker R H. The NCI60 humantumour cell line anticancer drug screen.[J]. Nature Reviews Cancer, 2006,6(10): 813-823.

2. Swinney D C, Anthony J. How were newmedicines discovered[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2011, 10(7): 507-519.

3. Zhang T, Chen Y, Li J, et al.Antitumor action of a novel histone deacetylase inhibitor, YF479, in breastcancer.[J]. Neoplasia, 2014, 16(8): 665-677.