原代細胞分離與培養，你都掌握了嗎？
第一部分：原代細胞的基本知識
1. 什么是原代細胞培養?
原代細胞（Primary cells）：是指直接從機體取出的組織或細胞獲得單個細胞并在體外進行培養的細胞。這里的組織主要指：組織器官、外周血及胚胎等。
原代細胞培養：由于原代細胞生長緩慢，繁殖一定的代數停止生長（一般10代以內）。所以一般認為：培養的原代的第1和傳代到第10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。
2. 原代細胞與細胞系（cell lines）的區別
原代細胞和細胞系的比較：
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Primary cells |
Cell lines |
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增殖能力 |
較弱 |
強 |
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繁殖代數 |
一般只能傳10代以內 |
無限增殖，50代左右 |
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遺傳物質完整性 |
遺傳物質未改變 |
遺傳物質發生改變 |
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生物特性 |
最接近臨床樣本 |
偏離臨床樣本 |
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培養容易程度 |
比較復雜 |
簡單，易操作 |
原代細胞和細胞系的比較
3. 原代細胞的應用
由于原代細胞生物學特性未發生很大改變，最接近和反映體內生長特性，因此是：
(1) 研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的工具；
(2)更好實現精準醫療的腫瘤診治模式，實現個體化精準用藥的目的。
第二部分：原代細胞分離和培養技術
原代培養的原理
將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶(常用胰蛋白酶/膠原酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。主要包括取材——分離——培養等3部分；
在原代細胞應用較多的包括：組織器官（如實體瘤、皮膚等）、懸浮細胞的取材等。
下面依次介紹：
一、腫瘤組織的取材
病人自體的原代腫瘤細胞由于更接近臨床患者標本，可以更好實現精準醫療的腫瘤診治模式，實現個體化精準用藥的目的。所以對病人自體腫瘤細胞體外分離與培養十分必要。
基本過程如下圖所示：
原代腫瘤細胞的分離步驟
備注：上圖細胞為肉瘤患者的原代細胞
具體步驟如下：
1. 在無菌條件下的冰上對新鮮離體的腫瘤組織，剔除包膜及壞死組織，無菌PBS清洗3-5次；切成約1mm3組織塊；
2. 加入2mmol 的 EDTA，搖勻后放置冰上約 30-60min；
3. 離心，并加入膠原酶消化（含蛋白酶）；
4. 消化期間，置于37°培養箱。每15min搖晃一次，消化時間根據腫瘤組織來定，約1-2h；
5. 待大部分組織塊消化成透明狀時，用 40μm 的細胞濾網過濾細胞，收集；
6. 用培養基重懸，置于培養箱培養。
常見問題解答：
Q：為什么我取得原代腫瘤組織，分離的卻不是腫瘤細胞？
A：取材時，我們要熟悉所需組織的類型和部位特征，選擇腫瘤細胞集中、活力較好的部分。避免結締等正常組織。
Q：若是細胞中混成纖維細胞，如何去除？
A：成纖維細胞的去除對于腫瘤細胞培養十分重要。由于成纖維細胞貼壁速度較腫瘤細胞快，可利用反復貼壁法使二者分離，進而達到清除成纖維細胞的目的。
Q：為什么離心后，沒有細胞分離出來？
A：需要考慮消化酶的因素，由于腫瘤組織較致密，胰酶無法消化，一般選用膠原酶，如膠原酶Ⅳ。若是組織十分致密可以再結合機械法，如研磨或者攪拌加速細胞分散。如下表為二者的區別：
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膠原酶 |
胰酶 |
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來源 |
細菌 |
胰臟 |
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消化組織 |
纖維多的硬組織 |
軟組織 |
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對細胞影響 |
傷害小 |
長時間有損傷 |
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作用力度 |
緩和 |
強 |
注：膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，根據分離的組織類型需選擇合適的膠原酶類型。
Q：消化時間如何確定？
A：具體的消化酶的量和消化時間可根據組織類型和多少進行調整。
Q：消化之前為什么用EDTA?
A：EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好。與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物后，形成的機械力可使細胞分散。
Q：細胞量太少，長不起來怎么辦？
A：有幾種辦法，如對沒消化完的組織塊反復消化，盡量多收集一些細胞；并且盡量傳代到小皿里，如6孔板都可以。若是細胞仍太少，應耐心等待，盡量不要傳代，只換液。
Q：細胞難以貼壁？
A：盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養能否成功的關鍵。為了盡快促進細胞貼壁，可以提前1h將千分之的明膠鋪于培養板。
Q：腫瘤原代細胞培養方法與細胞系不同之處在哪里？
A：培養基一般選用RPM1640，DMEM等，建議最好能加入促生長的物質：如胰島素、氫化可的松、雌激素、EGF等因子。
二、 原代正常組織分離
皮膚是人體最大的器官，但長久以來，表皮細胞一種被認為是難以培養的細胞，限制了皮膚生物學基礎研究的發展。作為表皮的主要細胞，角質形成細胞已經成為我們了解皮膚生物學至關重要的許多原創性研究的焦點。
下面就介紹下小鼠角質形成細胞的分離和培養�；具^程如下圖：
原代小鼠角質細胞的分離步驟
實驗結果：
分離出的小鼠角質細胞
常見問題解答：
Q：皮膚組織作為正常組織，與腫瘤組織分離主要區別在哪里？
A：首先，皮膚組織需要用中性分離酶dispaseII將表皮分離出來；其次，在消化時，用的是胰酶，而非膠原酶，并且胰酶的濃度用的是0.05%，而不是0.25%。
Q：表皮的分離需要注意什么？
A：表皮一般可以完整的撕脫下來，溫度的變化，孵育的時間以及所用的酶的濃度都會影響表皮是否能完整剝離。
Q：為什么需要無Ca血清來終止消化？
A：因為Ca2+的濃度可以影響角質形成細胞的生長，并且培養時必須嚴格調控培養基中的Ca2+濃度。
三、懸浮細胞分離培養
對于懸浮的原代細胞，如腹水或者胸水的癌細胞，可以直接低俗離心，將細胞洗滌幾次后置于合適培養基中。若是人為的骨髓或者外周血，則需要淋巴細胞分離液分層后再接種培養。
具體步驟我們這里不再贅述。若有相關問題，可以給我們留言。
懸浮細胞分離的注意事項：
分離后，注意抗凝，還要盡快分離后培養。不適合長時間低溫存放。
本期的內容就介紹到這里了，原代細胞分離培養與細胞系相比，難度加大了很多，不管哪一種組織的分離，一定要注意無菌。原代細胞是我們研究的重要工具。大家需要在實踐中多多練習，摸索最適合自己組織的分離方法和培養條件。
備注：腫瘤組織的原代細胞圖片提供者：王為芳；
小鼠角質細胞原代細胞圖片提供者：許鵬。
