蛋白磷酸化水平的變化可指針疾病的變化，但卻鮮有磷酸化蛋白被開發成為疾病診斷標記物。細胞外囊泡是由膜封閉的微環境，不受外界蛋白酶和其他酶的影響。這使得細胞外囊泡在體液中高度穩定，為開發磷酸化蛋白應用于醫學診斷提供了契機。

今天為大家介紹一篇細胞外囊泡中磷酸化蛋白相關的文章：

Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer

​PNAS , doi: 10.1073/pnas.1618088114

本篇研究從微泡和外泌體中提取和鑒定到迄今為止數目最多的磷酸化蛋白，并對健康組和疾病組（乳腺癌）的磷酸化蛋白進行相對定量分析。篩選出了多個潛在的生物標記物，并從中挑選了幾個靶點蛋白，用PRM的方法在健康組和疾病組中進行了后期驗證。

【主要結果】

1. 迄今為止最多，沒有之一

本實驗中共鑒定到9643個磷酸化特征肽段，是迄今為止在人血樣來源的細胞外囊泡中鑒定到數目最多的磷酸化肽段。實驗流程示意圖如下。

圖1. 實驗流程示意圖（健康組n=6,疾病組n=18）

2. 微泡、外泌體大不同

平均1mL人血漿中可鑒定到7000條磷酸化特征肽段。在外泌體中鑒定到的磷酸化肽段，其中50%在微泡中也可被檢測到。這些磷酸化蛋白主要參與細胞通訊、刺激響應和生物起源等生物學過程。微泡中酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸磷酸化所占比例分別為2.0%、14.1%、83.9%。而外泌體中酪氨酸磷酸化的比例則較高，為13.7%。與蘇氨酸的磷酸化比例（16.1%）接近。這表明微泡和外泌體的生物起源有很大差異。如圖2所示。

圖2. 微泡和外泌體中磷酸化肽段及磷酸化蛋白的分布

3. 不關蛋白組表達量的事，磷酸化水平確實升高了！

健康組與患病組細胞外囊泡蛋白組表達近乎一致的情況下，蛋白磷酸化水平卻表現出了顯著差異。表明這種差異不是由蛋白表達量的變化引起的，而切實反映了病患組細胞外囊泡蛋白磷酸化的程度（圖3）。

圖3. 微泡和外泌體蛋白組與磷酸化蛋白組的交疊維恩圖

4. PRM驗證實驗-完整而嚴謹

挑選了四種磷酸化蛋白RALGAPA2、PKG1、TJP2和NFX1用PRM方法，在13個癌癥患者和7個健康樣本中進行了驗證。結果表明這四種蛋白在癌癥患者中顯著高表達。

【小編心得】

這是一篇采用Label-free相對定量及PRM靶向驗證的方法，對乳腺癌患者細胞外囊泡進行磷酸化蛋白進行細致而完整的分析的一篇經典文獻。不僅建立了細胞外囊泡磷酸化蛋白組研究的方法，實驗中篩選到的磷酸化蛋白可望應用于癌癥的診斷和篩查中，為診斷醫學起到巨大的推動作用。

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