哺乳動物神經系統的發育是一個復雜的過程，在空間和時間上受基因表達的精確調控。對驅動神經系統發育的轉錄組研究，傳統方法主要采用低靶標數的原位技術或者對離體胚胎進行單細胞轉錄組測序，但隨著空間多組學技術的迅猛發展和成熟應用，目前研究人員可以實現在保留組織空間結構的基礎上，對組織切片中任何感興趣的區域（ROI）進行全轉錄組（～2萬個基因）或者蛋白質組（570多種蛋白質）的檢測和探究。

在2023美國神經學年會（SfN）上展示的一項研究中，研究人員利用GeoMx®空間多組學技術對健康C57BL/6小鼠胚胎E9-E15四個時間點上的小鼠中樞神經系統（CNS）和腸道神經系統（ENS）的特定解剖學組織亞結構進行了形態表征和全轉錄組檢測分析。研究人員觀察到不同空間位置的組織區域具有特異性的表達譜特征。這些結果為發育中的中樞神經系統和腸道神經系統關鍵結構的基因表達提供了豐富的時空圖譜，為神經疾病尤其是神經發育障礙研究提供了重要參考。
 

研究摘要

研究人員利用GeoMx® DSP對重點關注的神經組織區域中的75個感興趣區域（ROI）進行了全轉錄組的檢測分析。使用開源的GeomxTools R軟件包進行了LMM差異表達檢測和相關性分析。

樣本組織：分別處于E9、E11、E13和E15期的四只健康C57BL/6小鼠胚胎的新鮮冷凍矢狀組織切片（5µm厚），共17個組織樣本。

檢測方法：GeoMx小鼠空間全轉錄組檢測方案（GeoMx® Mouse WTA）：包含~20,000個蛋白編碼基因。

組織形態學標記：熒光標記的β3微管蛋白和p63蛋白來分別標記神經元和上皮細胞。

GeoMx® DSP工作流程

定量試劑：針對每個靶標RNA都設計了特異性探針，探針序列包括與靶標RNA特異性結合的捕獲序列；與靶標RNA一一對應的獨特分子標識條碼；以及將這兩段偶聯在一起的光可裂解的鏈接子。

成像試劑：熒光標記的抗體或RNA，用于展示組織的形態學特征，標記組織中特定的細胞類型或組織區域。

GeoMx采用了和標準免疫組化或原位雜交方法類似的樣本處理流程。具體將成像試劑（帶有熒光的形態學標記）、定量試劑（所有靶標的特異性探針）與組織切片進行共雜交。根據形態學標記所展現出的組織結構可以指導ROI的圈選。GeoMx® DSP儀器內置的百萬級微鏡陣列可以被數字化調控形成特定的反射面，進而將自下而上發射的紫外光反射為契合每個ROI形狀的紫外光束，精準地照射至該ROI區域，使得該區域中所結合的定量探針中的光可裂解鏈接子斷裂，其后端偶聯的分子標識條碼得以釋放，并及時地被上端極細的微針吸取收集至收集板特定的孔中。當所有的ROI照射和收集完畢后，進行測序文庫構建和高通量測序獲取每個靶標的表達量。

從新鮮冷凍固定組織圈選感興趣區域（ROI）

在中樞神經系統中，研究人員在前腦的三個矢狀切面上選取了25個ROI，并確定了E9發育期在端腦和間腦區域中表現出顯著差異表達的83個基因。這些基因中包含對神經元命運決定至關重要的形態發生因子。

與中樞神經系統相比，腸道神經系統的研究相對較少，因此研究人員在6個矢狀切面腸道神經元層上額外選擇了20多個組織區域（ROI），進行了進一步分析。研究人員觀察到，不同ROI中廣泛的轉錄差異取決于它們在腸道中的位置，也就是說腸道中不同空間位置的組織區域具有特異性的表達特征。

每個時間點的組織切片示例。彩色幾何圖形表示所分析的感興趣區域（ROI），一種顏色表示一個獨特的ROI。從17種組織中對圈選的733個感興趣區（ROI）進行分析：軀體、大腦、十二指腸、食道、前腸、心臟、腎臟、肢芽、肺、中腸、神經管、胰腺、咽部、胎盤、皮膚、胃和氣管。其中75個腦、神經管和腸ROI主要是神經細胞或部分神經細胞。

ROI大小范圍從1,400到180,000 µm2不等，平均每個ROI包含288個細胞。神經ROI范圍從4,000到110,000 µm2不等，平均每個ROI包含472個細胞。
 

神經元基因表達

對精選的1,000個重點關注基因在75個ROI中的表達分析

發育中端腦和間腦的轉錄差異

E9階段間腦（MES，n=8 ROIs）和端腦（TEL，n=10 ROIs）之間的基因表達差異。

與神經元發育和分化有關的基因

腸道神經系統及其周圍細胞的基因表達

顯示了E13階段腸道中涉及神經元分化的四個基因的空間分布。每個ROI均以歸一化基因表達量進行著色，箭頭指向神經元豐富的最外層 ROI。中腸ROI顯示在每張圖像的左上部分，胃ROI顯示在每張圖像的右下部分。

小結

GeoMx® DSP可對小鼠胚胎多個發育時期的多個組織中700多個感興趣區域進行分析；

與胚胎神經元發育和分化有關的部分基因在E9期端腦和間腦區域之間出現差異表達；

通過分析整個轉錄組，還得到了一些意想不到的新發現，比如發現Irx5等基因在不同腦區之間有不同的表達。該基因已知有助于產后神經發生，但在胚胎腦發育過程中卻未被描述過；

在ENS神經元和鄰近細胞中，觀察到各組織之間存在廣泛的轉錄差異，這些組織共同構成了腸道。

GeoMx® DSP 空間多組學分析系統

GeoMx® Digital Spatial Profiler（DSP）空間多組學平臺結合了組織影像分析和原位定量技術，可在展示全局組織結構的基礎上，進一步實現從復雜組織中對細胞亞群或特定結構的精準分析。在獲得高分辨率的樣本空間信息的同時實現高靶標蛋白（>570種蛋白質）和全轉錄組（~20000個基因）空間原位表達譜的精準獲取。最新的DSP工作流程可以支持在一張組織切片上同時檢測蛋白質和RNA的空間原位表達信息。GeoMx® DSP兼容多種組織樣本類型（如FFPE、新鮮凍存樣本等），成為基礎科研、轉化醫學研究和臨床實踐探究中強大有力的工具，使不同領域（如腫瘤學、免疫疾病、神經科學、藥物研發等）的研究人員能夠深入洞察組織微環境、功能亞結構、免疫系統作用機制和生物標志物發掘，滿足不同階段的研究和應用需求！