293T細胞被廣泛應用于瞬時轉染以過表達各種重組蛋白或病毒包裝，其優點包括高轉染效率、低成本的放大性和人糖基化模式^[1]。隨著基因治療和細胞治療的飛速發展，293T細胞越來越多地應用于腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體，重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體及慢病毒的生產^[2]。為實現更大規模的GMP生產要求以滿足基因治療、細胞治療領域相關研發和臨床實驗，越來越多的研究人員將目光轉向了生物反應器工藝。

從培養箱到生物反應器工藝過程中，有三大挑戰。首先，293T原本是貼壁細胞屬性，需要貼附在載體表面進行生長。目前最常用的貼壁載體為Cytodex1球狀載體，如Vero細胞在這個體系下細胞密度可達到1.0×10⁷ cells/mL以上。但293T細胞的貼壁牢固性較Vero細胞這類貼壁細胞弱，在微載體攪拌的過程中會導致細胞的脫落和死亡，因此在生產應用中仍有所限制。其次，貼壁的293T細胞在生長過程中需要添加血清等動物源成分，影響了后期的質量控制。最后，貼壁細胞在逐級放大過程中受到細胞消化效率的限制。面對這些挑戰，有研究人員將293T細胞馴化成無血清懸浮細胞株，解決了以上問題，但細胞密度只能在10⁶ cells/mL水平^[3]。

生物反應器作為大規模動物細胞培養的有利工具，已經被應用到293T懸浮培養工藝中。然而通常的批次模式下，營養成分的耗竭及代謝副產物的積累往往限制細胞生長及代謝，流加（Fed-batch）培養工藝因其操作簡單、過程放大容易、重復性高等優點已成為動物細胞大規模培養的主流模式。因此我們用293T 懸浮細胞在CloudReady™ 500mL生物反應器系統上進行了Fed-batch 培養，為293T懸浮細胞高密度表達提供參考（圖1），為病毒載體生產工藝提供新的可行性。
 

圖1 CloudReady™ 500mL生物反應器系統

操作過程

本次實驗以5×10⁵ cells/mL的細胞密度接種，將空氣和氧氣級聯DO，CO₂ 和 0.5 mol/L NaOH溶液級聯pH。其他參數控制和補料控制見表1和表2。另外，在第八天根據細胞實際情況又額外補加了10mL 293瞬轉表達用補料A和1mL 293瞬轉表達用補料B。

表1 工藝控制參數設定

 

結果

本次實驗進行了長達217h的培養周期，經過上述條件的控制，最終細胞密度達到了2.28×10⁷ cells/mL，并且活率維持在93%以上（圖2）。實驗過程中沒有通入0.5 mol/L NaOH溶液，pH最低值維持在6.7以上（圖3）。根據CARE（迪必爾生物應用技術與工程研究中心）前期培養293T細胞的經驗，pH控制在6.9-7.3，會造成大量的乳酸積累，培養期間持續增加至4.41g/L^[4]

此次實驗通過降低了pH設定值，乳酸濃度最大不超過2g/L，最后穩定在1.5g/L左右（圖4）。這樣的結果給下一步利用微小型平行生物反應器進行工藝優化提供了一定的參考。
 

圖2 239T細胞培養過程增殖曲線,“Fed”指補加293瞬轉表達用補料A和B兩種培養基。


圖3 293T細胞培養周期參數控制趨勢圖：紅色-溫度；黑色-pH;綠色-DO；黃色-轉速（rpm）；藍色-CO₂流速（mL/min）；灰色-空氣流速（mL/min）；橙色-氧氣流速（mL/min）。


圖4 239T細胞培養過程葡萄糖消耗曲線和乳酸鹽代謝曲線。

參考文獻

[1]. DEKEVIC G, TASTO L, CZERMAK P, et al. Statistical experimental designs to optimize the transient transfection of HEK 293T cells and determine a transfer criterion from adherent cells to larger-scale cell suspension cultures [J]. J Biotechnol, 2022, 346: 23-34.

[2]. ABAANDOU L, QUAN D, SHILOACH J. Affecting HEK293 Cell Growth and Production Performance by Modifying the Expression of Specific Genes [J]. Cells, 2021, 10(7).

[3]. TANG Q, GU L, WU H, et al. Establishing 293T suspension cultrue for lentiviral vector production in a stirred bioreactor [J]. 2020.

[4]. 汪興. HEK 293T細胞在一次性生物反應器（3L）的懸浮培養工藝. 迪必爾生物工程（上海）有限公司. 2023

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