免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。
     
很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用于檢測或定位抗體。
     
該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。

 

一、石蠟切片免疫熒光染色實驗步驟
1.多聚甲醛固定組織脫水：75%酒精4h；85%酒精2h；90%酒精1.5h；95%酒精1h；無水乙醇Ⅰ0.5h；無水乙醇Ⅱ0.5h。
2.組織透明：組織塊經酒精脫水后必須經過透明。透明劑（無水乙醇：二甲苯（1：1）溶液侵泡10min；二甲苯Ⅰ侵泡10min；二甲苯Ⅱ侵泡7min；）能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。
3.浸蠟：透明后的組織塊依次經3缸石蠟（60℃）進行浸蠟。石蠟Ⅰ（60℃）1h，石蠟Ⅱ（60℃）1h，石蠟Ⅲ（60℃）1h。以上3個實驗步驟都在生物組織脫水機里面完成。
4.包埋：包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟塊中。包埋用蠟的溫度應略高于浸蠟溫度，保證組織塊與包埋石蠟完全融為一體。
5.切片和烤片：切片前先將蠟塊切面在凍臺上冷凍幾分鐘，然后將所要切的包埋塊固定在標本夾上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸。右手轉動轉輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于42℃左右水浴展片鍋中，用鑷子將切片分開，然后用APES或多聚賴氨酸處理過的防脫玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，于60℃ 烤箱烤片3個小時即可。
6.切片脫蠟：將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-無水乙醇Ⅰ（5min）-無水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸餾水浸洗2min。
7.抗原修復：微波進行抗原修復，將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯中的不銹鋼切片架上，加適量的修復液（0.01M枸櫞酸緩沖液，pH6.0）于燒杯中，液面要浸過切片組織一定高度，微波爐可先用高檔加熱使液體沸騰，當加熱至沸騰時調到中檔，此時開始計時，修復時間為10-15min。到時間后將燒杯從微波爐中取出，放入冷水中冷卻降溫，當修復液降至室溫后取出玻片，用PBS（PH7.4）沖洗3遍，每次3min。
8.血清封閉：用吸水紙擦干玻片，免疫組畫筆在組織周圍畫圈，滴加稀釋好的正常山羊血清，室溫封閉30min，以減少非特異性染色。
9.一抗染色：甩去多余液體，不洗，然后滴加稀釋好的一抗，4°C濕盒中孵育過夜。
10.熒光二抗染色：PBST沖洗切片3次，每次3min，吸水紙擦干切片后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST沖洗切片4次，每次3min。
11.DAPI復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。
12. 用吸水紙擦干切片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

 

二、細胞爬片免疫熒光染色實驗步驟
1.在細胞培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3.0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min；
4.PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；
5.吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；
6.PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
7.DAPI復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8.用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。