基于非靶向的體內微生物代謝譜識別食品基質中的病原菌
發表期刊：Food Research International
影響因子：5.339
平臺：SPME/GC × GC- QTOF-MS
研究對象：微生物發酵液、空白發酵液、含菌食品（蝦、牛肉、豬肉和牛奶）、空白食品。
1.研究背景
目前，食源性病原菌是影響食品安全的首要因素，建立一種操作方便，有效實用的食源性病原體檢測方法顯得尤為重要。微生物揮發性有機物（MVOCs）檢測已經成為揭示食品中病原菌腐敗和污染的一種新穎且有效的手段，但是，MVOCs種類繁多，受微生物種類、生長基質、環境條件等多種因素影響，導致了MVOCs濃度差異巨大。
本文采用的新型的全二維色譜技術和疏水-親水平衡固相微萃取（SPME）探針技術具有物質分離效果好，捕獲代謝物范圍廣的優點。旨在通過對不同菌種的MVOCs檢測，尋找到不同微生物揮發性代謝標志物。從而建立一種食源性致病菌識別新方法。
2.研究思路
3.研究結果
1. 質譜方法優化
本文的適用性驗證基于聚合物復合萃取探針，將該探針與三個商用萃取探針相比較，包括DVB /CAR/ PDMS(50/30μm), PDMS / DVB(65μm)和PDMS(75μm)。從提取的Shigella sonnei MVOCs的總峰面積來看1-1，新型SPME探針具有較大的峰面積，提取效果最好。結合定性比較結果，PDMS或CAR/PDMS對雙極性化合物(如醇和酮)的靈敏度較低。與DVB/CAR/ PDMS相比，新型SPME探針具有更高的保留能力，更適合于提取不同理化性質的MVOCs。因此，新型的SPME探針有助于提供更全面的MVOCs譜，為我們后續的實驗提供了有力的工具。考察了氣相爐升溫速率和萃取時間對萃取效果的影響。優化結果如圖1-2，1-3所示。在初始溫度不變的條件下，以5℃ /min的加熱速率從50 ℃~ 230℃，對MVOCs的檢測靈敏度優于其他加熱方案。同樣，為了獲得更好的提取效果，根據圖1-3中總峰面積隨提取時間的延長而增加的結果，選擇60 min作為最佳條件。
圖1 1-1SPME探針纖維（左）；1-2溫度程序（中）；1-3提取時間（右）
2. MVOCs的鑒定與分析
優化后，將所建立的方法應用于5種食源性致病菌體內揮發性代謝產物的檢測，共鑒定出126種MVOCs為與細菌生長和代謝活性相關的優勢代謝產物。圖2-C為五種食源性致病菌的MVOCs的PCA分析，顯示了它們之間響應性代謝特征的分離，并初步評價了實驗的重復性。不同菌株間鑒定的代謝物的主要化學類別如圖2-A所示。主要的基團是酯類、烴類、醇類、酮類，其次是吡嗪類。在傷寒沙門氏菌(55.56%)、金黃色葡萄球菌(26.32%)和大腸桿菌(24%)中檢出大量碳氫化合物。副溶血性弧菌中烴類含量較低(3.57%)。其中，桑內志賀氏菌(34.38%)和金黃色葡萄球菌(26.32%)的酯類含量特別高。酮和醇的比例相近，吡嗪的含量低于其他四種。圖2B為五種致病菌獨有和共享的揮發物的維恩圖。具體來說，所有被研究的細菌都共用十二烷。2,4-二叔丁基苯酚和2-乙基己醇由副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌共同擁有。此外，副溶血性弧菌與鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌共有2-十五烷酮、鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯，與松內志賀氏菌和大腸桿菌共享1-辛醇和1-癸醇。金黃色葡萄球菌、志賀菌和大腸桿菌共享十八烷，前兩種菌共有2,5-二甲基-3-異戊基吡嗪和2-戊基呋喃，后兩種菌共有苯乙酮和3-苯基呋喃。痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌與十一烷共有，而桑氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌與2,6-二乙基吡嗪共有。大腸桿菌與溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別共有吲哚、環戊烷酮和2,5-二甲基吡嗪。副溶血性弧菌分別與鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌共有(z)-6-pentadecen-1-ol和二甲基三硫。
圖2 五種食源性病原體的主要化學類別的分布(A)；五種食源性病原體所釋放的獨特和共有的揮發性代謝物的維恩圖(B)；5種食源性致病菌MVOCs的PCA圖（C）
3. 微生物的代謝生物標志物圖譜
微生物的揮發性代謝產物深受培養基的影響，因此進一步分離和分析培養基與微生物之間的差異，對于尋找微生物獨特的代謝標志物具有重要意義。分別構建了5個OPLS-DA模型來區分5個研究純菌株及其無菌培養基的代謝產物譜。結果如圖3所示。然后用VIP值超過1作為卡值標準，結果如圖4所示。不考慮培養基的影響，多變量篩選得到22個差異代謝物。為了進一步明確有效的生物標記。在圖5中考慮了純培養基與菌株峰面積的比較。與無菌培養基相比，吲哚、2-十一烷、降植烷、2-己基呋喃、1-壬醇、丁基羥基甲苯、1-癸醇、3-甲基丁酸、2-十二烷酮、甲基-2,4-癸烯酸甲酯和2-十四烷酮的峰面積顯著增加。說明上述物質是菌株自身代謝的優勢化合物。結合前人研究，五種食源性致病菌的潛在揮發性代謝標志物如下1-壬醇(志賀菌)、丁基羥基甲苯(志賀菌)、2-己基呋喃(志賀菌)、降植烷(鼠傷寒桿菌)、1-癸醇(大腸桿菌)、甲基-2,4-癸烯酸甲酯(金黃色葡萄球菌)、2-十二烷酮(金黃色葡萄球菌)、3-甲基丁酸(金黃色葡萄球菌)、以及2-十四酮(金黃色葡萄球菌)。吲哚是大腸桿菌和副溶血性弧菌共同擁有的潛在的揮發性標記物。
圖3 微生物培養體系與空白微生物培養基揮發性代謝物的OPLS-DA得分圖
圖4 通過OPLS-DA分析，得到5種致病菌的總化合物
圖5 菌株與無菌培養基差異變量的統計分析結果
4. 食品中五種致病菌潛在揮發性標記物的檢測
食物基質可能不同于肉湯培養系統。因此，通過實際食品樣本驗證新型SPME探針在病原細菌識別中發現的潛在揮發性標記物，以支持所建立方法的實用性。根據細菌宿主的實際情況，對蝦、牛肉、豬肉和牛奶三種食物基質進行了調查。分別測定了各細菌在相應的食物基質和培養基上生長的潛在揮發性標記物的峰面積，其產率隨時間的變化曲線如圖6所示。受污染的食品樣本中金黃色葡萄球菌的3-甲基丁酸和2-十一烷酮、大腸桿菌的吲哚和1-癸醇、副溶血性弧菌的吲哚和2-十一烷酮的信號強度先升高后降低。鼠傷寒沙門氏菌的降植烷和金黃色葡萄球菌的甲基-2,4-癸烯酸甲酯以及2-十四烷酮的信號強度逐漸升高。食物中致病菌代謝標志物濃度的變化與細菌在培養基中的生長趨勢一致。另外，上述化合物均未在實際樣品的對照組中檢測到。結果表明，食物基質中的微生物利用食物中豐富的營養物質進行自身生長繁殖，并繼續產生自己獨特的代謝產物。
圖6 分別在培養基和食物基質中培養的菌株潛在揮發性化合物的信號強度隨時間變化的結果:(A)大腸桿菌;(B)鼠傷寒沙門氏菌;(C)副溶血性弧菌;(D)桑氏志賀氏菌;(E)金黃色葡萄球菌。
4.結論
本研究成功地將新型SPME探針與GC×GC-Q-TOF-MS相結合，應用于五種食源性致病菌體內揮發性代謝物的檢測。通過多元統計分析，篩選出11個潛在的揮發性標記物，并在特定的食品基質中進行了驗證
本研究結果突出了體內揮發性代謝物作為食源性致病菌生長和代謝狀態指標的適用性，為微生物代謝組學的研究提供參考，該方法可為微生物識別提供一種簡單、高效、靈敏的替代方法。
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