來自Univercells的概念驗證研究 – 可放大的HEK293細胞生長和腺病毒生產

早期到晚期臨床開發中的基因和修飾細胞治療（例如，嵌合抗原受體[CAR] T-細胞治療）在多種疾病的治療以及潛在治愈方面顯示出了良好的前景。這類新一代藥物中的多個產品已經獲得了審批并開始進入市場。

盡管有大量候選藥物的管線開始進入臨床試驗階段，但其仍面臨著可能的生產瓶頸 – 病毒載體生產 – 其可能延遲產品的商業化進程。

與使用懸浮細胞培養的大多數基于工程蛋白質的生物制品不同的是，病毒載體的生產需要使用以基質作為支持的貼壁細胞。目前，有兩種選擇可用于貼壁細胞生長：使用微載體或多層靜態式塑料器皿。

微載體懸浮在罐內，并通過攪拌提供一個均質的環境。但是，對于用于病毒載體生產的剪切敏感型細胞來說，攪拌會是一個極具挑戰的過程。由于反應器內流體動力學狀態的變化，工藝規模放大也需要較多的工作。此外，這種工藝很難達到高細胞密度，而且規模放大需要使用大量昂貴的轉染試劑。

出于這些原因，傳統上會使用靜態的塑料器皿，進行貼壁細胞的生長、轉染以及腺病毒載體的生產。但是，這種方法也有一定的局限性。首先，其不能實現精確的環境控制（pH、溶氧[DO]、培養基組成），需要大量的人工干預操作。此外，規模放大也很難實現，只能進行規模擴展。
 

一種可規模放大的解決方案

Univercells提供的可規模放大且自動化的一次性使用固定床生物反應器可解決這些技術難題，為制藥廠商提供了一個以可負擔的方式向市場提供所需數量產品的機會。生物反應器的示意圖如圖1所示。

由螺旋卷式的非編織聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）織物層組成的緊密填充的支撐基質，可在小體積生物反應器內實現高細胞密度。位于生物反應器內的磁性離心葉輪具有兩種功能：良好的混勻，以確保營養物質在整個固定床內均勻的分布，以及通過在罐頂部空間形成“降膜”，以增加氣體交換的表面積，從而進行通氣。培養基在細胞間溫和循環，提供類似于靜態塑料器皿中的條件，并保證在垂直和水平方向上均具有均勻的環境。

系統包括自動pH、DO以及溫度控制；自動接種及手動培養基和細胞取樣；以及通過循環回路進一步添加培養基的泵。

規模縮放通過增加固定直徑的高度（~10-、20-以及30-cm固定床高度）、然后平行增加直徑（10、20以及30cm）來實現。由于流動通過固定床的液體培養基的線性流速在所有規模條件下保持恒定，所以細胞處于相似的低剪切狀態。系統的自動化功能和簡單的規模放大可實現病毒載體更快速的開發和商品化。
 

工藝轉換研究

通過使用相同的接種密度以及培養基比例體積，比較了在scale-X hydro 生物反應器系統和標準塑料細胞培養瓶中進行的工藝的性能，以研究將病毒載體生產從靜態塑料器皿轉換至固定床生物反應器的簡單性。

在scale-X hydro系統中進行的細胞培養工藝包括5個步驟：（1）生物反應器準備，（2）接種和細胞黏附，（3）細胞擴增，（4）病毒感染以及（5）收獲（圖2）。



實驗使用來自凍存細胞庫（Momotaro-Gene）的HEK293細胞。接種液在標準條件下，在細胞培養瓶中制備。工藝過程中，監測細胞密度和病毒滴度（使用光學顯微鏡進行目檢計數）和代謝物（葡萄糖、乳糖）濃度（離線代謝物分析儀）。

在所有工藝中，細胞擴增時連接一個外部的培養基源，接種后不久，開始通過生物反應器進行循環（圖2）。在第一個生物反應器中（#1），培養基在第3天置換，以使細胞進一步生長，但細胞不進行感染。在生物反應器#2和#3中，細胞擴增以批次模式分別進行2和3天，然后細胞感染。盡管細胞在感染后，會自然裂解，但仍使用去垢劑，以提高產物收率。

成功的細胞生長和感染

在相同條件下，固定床生物反應器（#2和#3）中的細胞生長高于標準塑料器皿。（結果如圖3所示。）從圖中可見，固定床生物怒反應器在第3天（2.1 x 10⁵ vs. 1.3 x 10⁵ cells/cm²）和第6天(6.5 x 10⁵ vs. 3.2 x 10⁵cells/cm²) 的性能優于標準塑料器皿。注意，塑料器皿和生物反應器使用相同的培養基置換比例，以在第6天達到高細胞密度。

所有生物反應器均在接種后，使用4.2L 外置培養基循環回路進行操作。在第3天，生物反應器#1的外置培養基循環回路更換為新鮮培養基，從而使細胞進一步生長至第6天。生物反應器#2和#3以批次模式進行操作，然后感染（分別在第2天和第3天進行）。感染后細胞密度未顯示。生物反應器#2的對照細胞密度未提供。

感染在達到目標細胞密度條件時（生物反應器#2和#3分別在第2天和第3天）進行，觀察到所有細胞在感染后第3天裂解。使用相同的去垢劑處理，收獲每個工藝的產物。由于未進行任何的工藝開發工作，所有生物反應器內的病毒滴度約比對照塑料器皿低1 log IRU。

通過工藝優化進一步提升的潛力

研究證實，基于靜態塑料器皿的產基因治療用腺病毒的HEK293工藝可成功轉換至Univercells scale-X生物反應器系統。系統在小體積生物反應器內達到極高細胞密度和良好病毒產量的潛力，突出了系統實現高水平生產的能力，且設備占地大大降低，同時可實現自動化工藝步驟。

值得注意的是，在靜態塑料器皿和固定床生物反應器內進行的工藝獲得了相似的結果，而生物反應器內進行的工藝并未經過太多的優化工作。Scale-X hydro 生物反應器內獲得的更高的細胞密度很好的反映了系統內更好的環境控制（pH和DO），這有利于實現穩定的生產環境。結合非常有潛力的病毒產量結果，更高的細胞密度為進一步的工藝開發打開了大門。

未來的工作將集中于關鍵工藝參數（CPC）的確定，以優化生物反應器內的細胞培養條件，這在傳統靜態工藝中是無法實現的，因其缺乏工藝參數的控制，如pH和DO。

Scale-X™ hydro 系統是生物反應器產品線的一部分，該產品線可用于生物工藝開發和中試規模培養（scale-X™ hydro 2.4 m² 和carbo 10-30 m²）、中到大規模工業化生產（scale-X™ nitro， 200-600m²，一般適用于疫苗生產）以及更大規模工業化生產（scale-X™ oxo， >2000m²，滿足基因治療需求）。已經計劃了進一步的實驗，以證實工藝向這些更大規模生物反應器的可放大性。

原文翻譯：Y.Dohogne, F.Collignon, J,Drugmand, et al., Transferring Viral Vector Production from Plasticware to a Fixed-Bed Bioreactor. Genetic Engineering & Biotechnology News, 2019, 39 (2): 60-62.
 

Headquarters & Bioprocess Design Center: 
Rue Auguste Piccard 48, 6041 Gosselies, Belgium

Administration & Business Office: 
Avenue de Tervueren 270, 1150 Woluwe-Saint-Pierre, Belgium

Contact: （+32）2 318 83 48
info@univercells.com
www.univercells.com

中國地區聯系人：

a.yip@univercellstech.com

© Univercells S.A.
Univercells and Univercellstech logos are trademarks of Univercells S.A