應用 LAL動態濁度法測定復方苦參注射液中細菌內毒素含量
 

王信１，馮宇２*，范祥元３，楊喆２，高蕾２（１. 國家食品藥品監督管理總局高級研修院，北京 100073；２. 科德角國際生物醫學科技（北京）有限公司，北京 100068；３. 安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 230051）

摘要 目的：建立應用美洲鱟試劑LAL的動態濁度法定量檢測復方苦參注射液中細菌內毒素試驗方法。
方法：采用《中國藥典》2015年版（四部）中的細菌內毒素檢查法。結果：復方苦參注射液用細菌內毒素定量法檢測無干擾因素影響，內毒素回收率在50%~200%范圍內。結論：使用LAL進行動態濁度法定量檢測復方苦參注射液的細菌內毒素是可行的，可用細菌內毒素方法代替兔熱原檢查法，同時又避免了限量法內毒素檢測時的干擾。
關鍵詞：復方苦參注射液；細菌內毒素；動態濁度法；干擾試驗；美洲鱟試劑

復方苦參注射液又名巖舒注射液 (compound Kusheninjection, CKI)，是由苦參、白土苓兩味藥經

提取加工精制而成的純中藥制劑，收載于衛生部藥品標準^[1]，具有清熱利濕、涼血解毒、散結止痛之功

效。現代研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、鎮痛、提高機體免疫力等多種藥理作用，臨床上廣泛用于非小

細胞肺癌、原發性肝癌、消化道癌及惡性胸腔積水等重癥疾病的輔助治療^[3-8]。目前我國藥品標準對復方苦參注射液采用家兔法進行熱原檢查。但家兔熱原檢查操作復雜，影響因素多，而細菌內毒素限量檢查又具有較大的干擾性^[9]，故選用動態濁度法測定其細菌內毒素以消除其干擾，結果準確可靠。而目前對復方苦參注射液的檢測研究多基于東方鱟試劑TAL，基于美洲鱟試劑LAL的檢測鮮有報道，本文主要應用 LAL對復方苦參注射液進行動態濁度法檢測，同時所采用的儀器耗材均為美國 ACC產品，結果準確可靠，符合美國FAD相關標準，從而為復方苦參注射液的美國 FAD認證申報提供參考。

1 材料與儀器
復方苦參注射液(山西振東制藥股份有限公司)；LAL試劑(批號 516-06-789-T，λ=0.001EU·mL^-1，規格 5mL/瓶，美國 ACC公司)；細菌內毒素工作標準品(批號 154,美國 ACC公司);細菌內毒素檢查用水(批號 AB215748，規格 50mL/瓶，美國ACC公司)；PKF96細菌內毒素檢測儀(美國 ACC公司)｡

2 方法與結果
2.1 細菌內毒素限值的確定^[1]
公式為：L=K·M^-1，K為規定的給藥途徑，即人每公斤體重每 1h最大可接受的內毒素劑量，注射
劑為 5.0 EU·kg^-1；本品的日靜脈注射量為 12mL，加入 0.9% 氯化鈉注射液 200mL中靜滴，靜注時間
按 1h計。中國人均體重按 60kg 計算，則 M為 1h每公斤體重人的最大給藥劑量為 0.2mL·kg^-1，計
算得樣品的內毒素限值 L為 25 EU·mL^-1｡

2.2 標準曲線制備及可靠性^[2]
用細菌內毒素檢查用水 LRW 將內毒素工作標準品進行 5倍稀釋，最終細菌內毒素濃度分別為
0.625､0.125､0.025､0.005､0.001EU·mL^-1稀釋系列；各取 0.1mL樣本分別加到反應管內，后加入
0.1mL LAL 試劑并渦旋 1-2秒混合均勻,立即插入PKF96細菌內毒素檢測儀內進行自動檢測，其中每
一個濃度重復 3管｡  儀器自動繪制標準曲線,結果見圖 1。回歸方程：LgT=2.667-0.3029LgC其中相關系數 r=-0.994；最低濃度 λ=0.001EU·mL^-1；空白對照管在檢測時間外,故標準曲線成立｡

圖 1 標準回歸曲線
Fig.1 Standard Curve

2.3 干擾試驗
2.3.1 樣品稀釋倍數計算^[3]
公式為:MVD=L·C·λ^-1｡L為復方苦參注射液內毒素限值；C為1.0mL·mL^-1；λ為標準曲線的最低內毒素濃度0.001EU·mL^-1；計算得復方苦參注射液最大有效稀釋倍數 MVD為 25000倍(由于美國 ACC鱟試劑的靈敏度較高，λ值較低，故可稀釋倍數更大)｡

2.3.2 樣品溶液配制及干擾試驗
將復方苦參注射液用內毒素檢查用水 LRW 依次稀釋為 200,400,500倍溶液，記為 A溶液；同時另取 3管，進行 100,200,250倍數稀釋，但在稀釋液中添加等體積濃度為 0.05 EU·mL^-1的細菌內毒素工作標準品溶液；作為樣品添加內毒素陽性對照管，記為 B溶液(經此步操作保證 B溶液最終樣本稀釋倍數仍為 200､400､500倍,內毒素工作標準品終濃度均為 0.025EU·mL^-1)；分別取上述各液 0.1mL，加入預先加
有 0.1mL LAL 試劑的反應管內, 渦旋 1-2s混勻立即插入 PKF96細菌內毒素檢測儀內進行檢測，其中每一個濃度重復 3管，儀器軟件會自動計算回收率｡
回收率 (%)=(B液內毒素值-A液內毒素值)/0.025×100%｡ 結果見表 1｡
標準曲線：LgT=2.667-0.3029 LgC  r=-0.994｡

樣品的添加內毒素平均回收率均在 50% ~200%范圍內，符合中國藥典 2015年版第四部及美國藥典 85 of USP 39 規定，表明樣品的 3個濃度溶液對鱟試劑 LAL均無干擾影響｡

2.4 樣品溶液定量試驗
分別取 4 批復方苦參注射液,用內毒素檢查用水 LRW 依次稀釋為 200 倍溶液，記為 A溶液；同時另取 3管，進行 100倍數稀釋，但在稀釋液中添加等體積濃度為 0.05 EU·mL^-1的細菌內毒素工作標準品溶液;作為樣品添加內毒素陽性對照管，記為 B溶液(經此步操作保證 B溶液最終樣本稀釋倍數仍為 200倍，內毒素工作標準品終濃度均為 0.025 EU·mL^-1)；其中每個濃度重復 3管，計算回收率，結果見表 2。4批復方苦參注射液的回收率均在50% ~200%范圍內，表明復方苦參注射液在本試驗條件下對 LAL 無干擾，因此日常檢驗選用 200倍稀釋液即可。結論：4批次復方苦參注射液內毒素含量均符合規定｡

3 討論
3.1 干擾實驗符合藥典規定
從復方苦參注射液的干擾試驗結果發現：復方苦參注射液用美洲鱟試劑 LAL進行細菌內毒素動態濁度法檢測，由于內毒素回收率在50%~200%范圍內，表明不存在干擾因素影響，且 ４批復方苦參注射液（未超過 MVD的四個稀釋梯度）的內毒素含量均在規定限度25 EU· mL^-1 以下。
 

表1 復方苦參注射液干擾實驗結果
Tab 1  Radix Sophora Flavescentis Injection interference test result

 

表 2 復方苦參注射液定量試驗
Tab.2  Radix Sophora Flavescentis Injection quantitive test

３.２ 動態濁度法可代替傳統家兔法
用傳統的家兔法檢測細菌內毒素，由于操作復雜，影響因素多，對試驗結果影響很大。利用美洲鱟試劑 LAL動態濁度法進行細菌內毒素定量檢測，具有操作簡便，結果準確，檢測靈敏度高等優點，尤其避免了由于家兔差異及人為主觀判斷所出現的假陽性或假陰性結果。經過動態濁度法試驗，樣品的細菌內毒素定量檢測各項結果均符合中國藥典 2015(四部)及美國藥典 85 of USP 39要求，說明使用美洲鱟試劑LAL 進行細菌內毒素動態濁度法測定復方苦參注射液的細菌內毒素是可行的，可代替傳統家兔熱原檢查法。

３.３ 實驗結果可追蹤充分保證數據完整性

實驗中所有實驗數據均可進行審計追蹤，美國 ACC內毒素檢測儀配套軟件Pyros EQSv1.2經美國FDA認證，配備有oracle數據庫，能夠提供強大的審計追蹤功能，充分保證數據完整性及安全性。便于今后復方苦參注射液美國 FDA的認證申報。

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