如何根據細胞種類的特性科學鋪板培養
如下圖為：細胞鋪板時，常出現的細胞分布不均勻現象。
細胞居中和細胞邊緣化
首先，了解一下細胞鋪板的必要性！
從經濟和高效的角度來說，需要根據實驗目的選擇不同規格的培養板。如在進行藥物對待測細胞半抑制率（IC50）測試時，通常使用96孔板，一方面可以設置濃度梯度；另外還可一次性測多個藥物，減少實驗誤差。
如下表格：
常見的幾種培養板規格及其應用
細胞鋪板主要分為3大步驟：收集細胞→細胞計數→細胞鋪板
一、收集細胞
即把培養皿/瓶的細胞消化收集，與傳代一樣，不再贅述。
二、細胞計數
一般傳代的細胞密度較大，在鋪板時最好控制細胞數量。一般采用血球計數板計數，對于體積較大的細胞如腫瘤細胞采用下圖藍色部分的白細胞計數區域，即利用四個角的四個大方格。
血球計數板模式圖（圖片來自百度）
計算原理：由于每個大方格子（紅框），邊長為1mm，蓋上蓋玻片后的高度為0.1mm，因此計數室內加滿細胞懸液的體積為0.1mm3=10-4cm3=10-4ml。
細胞數量 = 4個大格子的平均數*稀釋倍數*104個/mL
常見問題解答：
Q：細胞計數前后出現較大誤差？
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考慮細胞沉降導致懸液不勻；懸液體積過大或過小；稀釋倍數太高或太低等原因造成。
Q：如何克服細胞懸液不均勻的問題？
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盡量將細胞吹打為單個，防止抱團，且用移液槍充分吹打，使其均勻懸浮在培養基中。
Q： 一般加多少細胞懸液合適？
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由于加入計數室的量，過少會導致計數室內出現氣泡，過多則會使得計數板上的蓋玻片不緊貼計數板，使得高度變高，體積變大；計數室體積為9mm3，所以一般加15ul左右。
Q： 計數時，細胞稀釋倍數如何控制？
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若是計數室細胞過稀或過密，會造成較大誤差，一般最適濃度為5～10×105細胞/ml。如一般10cm皿的細胞約300-500萬個，一些細胞個體小也能達到1000-2000萬，可根據所需細胞數目取出部分作稀釋或連續稀釋后計數。舉例來說可將100ul細胞懸液加入到900ul培養基中，混勻后進行計數，計數所得乘以10即為實際細胞密度。
Q： 計數的原則有哪些？
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計數時對壓在最外圈邊線的細胞遵循“計上不計下，計左不計右”的統計學原則，遇到兩個以上的細胞組成的細胞團計為一個細胞。
三、細胞接種
根據操作手法，一般分為2類：
第一類：6孔板、12孔板和24孔板
各種培養板規格（來自Thermo Fisher）
操作步驟：
① 稀釋細胞：根據上述計數結果后，將細胞稀釋到目的濃度；
② 加入細胞懸液：充分混勻后，貼壁加入細胞懸液；
③ 搖勻：這一步很重要！接種結束后，將板在超凈臺上十字形搖勻，最后于顯微鏡下觀察。
注意事項：
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鋪板后，不可以轉圈搖，因為細胞會被帶到中間；
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如果培養液量少，由于瓶體內液體有向邊緣吸的特性，所以造成中間低洼，細胞容易聚集。可以多加點液體緩解，若6孔板一般加2ml，我們可以加到2.5ml。
第二類：96孔板/384孔板
96孔板/384孔鋪板時步驟與上述基本一致，只是多使用排槍，即不用搖勻。
96孔板/384孔板（來自Thermo Fisher）
注意事項：
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用排槍吸取時，一定要保證每個槍頭吸上來的懸液體積一致；
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鋪96孔板時，如果是用于進行MTS等長時間測試時，最外圈應空余出來，不接細胞，加入一圈PBS或多于細胞懸液，以防止培養基蒸發引起的邊緣效應；
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96孔板或384孔板鋪好細胞后最好不再搖晃，小心地放入培養箱即可。
常見問題解答：
Q： 如何避免每個孔之間的細胞不均勻？
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鋪板速度盡量快點，在加完半邊板后，需要再次將培養皿內剩余的細胞懸液充分混勻再繼續鋪板。
Q：十字形搖勻具體是怎么搖？
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放在水平板面上先上下移動，再左右移動，每個方向5到6次。
Q：對于某些容易聚團的細胞，該怎么辦？
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對于容易聚團的細胞，盡管當時搖勻了，但是靜置30min后，取出后將細胞培養板后，肉眼即可見嚴重的細胞居中抱團現象，比如乳腺癌細胞MDA-MB-231。對于這種細胞解決辦法：從個人經驗來看，若是時間允許的話，可以降低接種密度，可以隔一天細胞多了再進行藥物處理或者劃線等。
Q：為啥要貼側壁加入細胞懸浮液？
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一般從孔的左邊靠近底部貼壁加入，不要從中間加入；因為接種之前已將細胞懸液做過充分混勻，直接從側壁加入能盡量保持細胞懸液的均勻狀態；另外貼側壁加入也能減少孔內氣泡的產生。
Q：如何把握細胞密度？
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細胞密度對于鋪板很重要，過密很容易造成細胞居中，過稀會造成細胞難以生長起來。一般進行預實驗，我們通常會設計一組不同細胞密度對報告基因度值影響的預實驗，從而根據實驗結果來確定細胞的具體接種數量。
Q： 有些貼壁不牢的細胞在細胞培養板中收取上清或移除上清時應注意什么？
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有些細胞如293T細胞貼壁不牢，如果需要在96孔板中進行實驗時，如果需要吸除上清，應避免直接使用吸泵等吸力過大的設備，另外可以在收板時使用培養板專用離心機離心后在取出上清。另外也可以在接板前使用千分之一的明膠提前加入培養板中，在培養箱孵育30分鐘以上后再將細胞接入。
細胞鋪板是個熟能生巧的實驗，本期我們是根據多年實戰經驗介紹的技巧，供大家參考，但鑒于每個人手法不同，培養的細胞特性也因人而異，因此，還需要實踐中多多練習，了解你手中細胞的特性，進而擁有一套屬于你的操作手法。如果你的實驗中有更好的方法，也歡迎大家積極討論，互相學習！
