近日，華中科技大學的研究人員報告稱，多發性骨髓瘤的細胞外囊泡（MM-EV）有望作為新型的生物標志物，應用于骨髓瘤骨病的診斷和治療。

這篇題為“Tumor-derived extracellular vesicles inhibit osteogenesis and exacerbate myeloma bone disease”的文章于1月發表在《Theranostics》雜志（IF: 8.537）上。華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院的李秋柏教授和生命科學與技術學院的郭安源教授為共同通訊作者。

背景介紹

在我國，多發性骨髓瘤（MM）的發病率已超過急性白血病，位居血液系統惡性腫瘤的第二位。大約80%的患者會出現骨髓瘤骨病（MBD），嚴重影響了患者的生活質量及生存期。MBD的特點在于成骨細胞活性嚴重受損，這是因為骨髓來源的間充質干細胞（BM-MSC）成骨功能受阻。不過，受阻的具體機制還不太清楚。

最近，越來越多的證據表明，細胞外囊泡（EV）是以往被忽略的細胞間通訊機制。癌細胞會釋放含有多種分子的細胞外囊泡，如蛋白質、RNA和miRNA，影響腫瘤微環境。于是，研究人員此次研究了骨髓瘤細胞外囊泡（MM-EV）的生物活性成分，并檢測了它對BM-MSC成骨功能以及骨髓瘤骨病的影響。

MM-EV富含調節MBD的各種分子

研究人員從人多發性骨髓瘤細胞系RPMI 8226和U266中分離出MM-EV，分別稱之為R-EV和U-EV。這些EV為球形，大小在200-1000 nm。它們是CD138、Annexin-V和PKH-26陽性的，同時表達EV標志物Alix、TSG101、CD63、MFGE8或CD9。

之后，他們對R-EV中的RNA分子進行測序。由于miRNA被選擇性分泌到EV中，并充當主要調節因子，他們重點分析了R-EV中包含的miRNA，并與來自B細胞和K562白血病細胞的EV進行比較。R-EV表達了287種miRNA，而K562-EV表達176種miRNA。

他們發現，一些調節細胞增殖的miRNA在R-EV和K562-EV中高表達。有意思的是，一些參與成骨細胞或破骨細胞分化的miRNA只在R-EV中高表達，如miR-103a-3p、miR-181a-3p和miR-21-3p。這些結果表明，R-EV所包含的miRNA不僅在細胞增殖中發揮作用，還與骨髓瘤骨病的發展相關。

MM-EV在體外抑制BM-MSC的成骨功能

接著，研究人員試圖確定MM-EV是否會影響BM-MSC的成骨功能。他們用80%成骨分化培養基和20%未過濾MM細胞培養基（RPMI 8226、U266和KM3）或條件細胞培養基（通過離心和過濾去除EV）處理BM-MSC。21天后，通過染色檢查BM-MSC的成骨細胞克隆數CFU-OB，他們觀察到未過濾的培養基比條件培養基具有更明顯的抑制作用。這些結果表明，EV對BM-MSC發揮成骨抑制作用。其中，原代BM-MSC及成骨分化培養基購自賽業生物。

他們隨后用來自RPMI 8226（R-EV）、U266（U-EV）或KM3（K-EV）細胞的MM-EV直接處理BM-MSC。他們發現，BM-MSC經過MM-EV處理后的成纖維細胞和成骨細胞克隆數明顯少于對照，其中，R-EV發揮最大的抑制作用。接著，他們檢測了成骨相關生物標志物的改變。他們發現，四種基因（RUNX2、ALP、osteocalcin和collagen I）的表達水平被一種或所有的MM-EV明顯拉低。這些結果確認了MM-EV抑制BM-MSC的成骨功能（圖1）。

圖1. MM-EV抑制BM-MSC的成骨功能

既然miRNA在調節成骨中發揮了重要作用，那么MM-EV是否誘導BM-MSC的miRNA表達變化？研究人員之后通過miRNA測序分析了這一點。他們發現，BM-MSC經過MM-EV處理后，變化最大的miRNA包括miR-181a-3p、miR-21-3p、miR-103a-3p和miR-107，其中miR-103a-3p對于成骨至關重要。通過實時定量PCR證實，R-EV誘導BM-MSC中miR-103a-3p的高表達。這表明此種miRNA可能與成骨抑制作用有關。

MM-EV讓小鼠模型的骨髓瘤骨病惡化

之后，研究人員開展了體內研究。他們將RPMI 8226細胞和/或R-EV直接注射到脛骨，建立了小鼠模型。Micro-CT顯示，MM-EV組和MM組左脛骨骨干的骨密度等各項指標都明顯低于對照組。染色結果也表明了嚴重的骨破壞和MM細胞浸潤，以及MM組和MM+MM-EV組的成骨細胞更多，破骨細胞更少。這些結果說明，單次注射R-EV可以降低小鼠脛骨的成骨功能，與體外研究結果一致（圖2）。

此外，R-EV還可以增強MM細胞的活性，加劇MM細胞誘導的成骨功能降低，并顯著增加MM誘導的破骨細胞分化。這些結果支持了R-EV推動小鼠模型的疾病進展。

圖2. 小鼠脛骨的Micro-CT分析

外周血CD138⁺ cirEV水平指示骨病變

最后，研究人員從新發骨髓瘤患者的外周血中分離出cirEV，以評估cirEV水平與BMD及其他骨髓瘤臨床特征之間的關聯。他們發現，CD138⁺ cirEV計數能夠區分新發患者和健康供體。對于骨髓瘤骨病，他們還發現CD138⁺ cirEV計數與骨病變的數量有關，存在0處、≤ 3處和> 3處骨病變的患者在結果上明顯不同。這些結果表明，外周血CD138⁺ cirEV計數是骨髓瘤骨病的潛在診斷標志物。

“雖然以往的研究認為細胞外囊泡在骨髓瘤中發揮了不同作用，但我們提出首個證據，表明MM-EV在體外抑制BM-MSC的成骨功能，并讓小鼠的骨髓瘤骨病惡化，而外周血CD138⁺ cirEV對骨髓瘤骨病具有診斷意義，”作者在文中總結道。

原文檢索

Zhang L, Lei Q, Wang H, Xu C, Liu T, Kong F, Yang C, Yan G, Sun L, Zhao A, Chen W, Hu Y, Xie H, Cao Y, Fu F, Yuan G, Chen Z, Guo AY, Li Q. Tumor-derived extracellular vesicles inhibit osteogenesis and exacerbate myeloma bone disease. Theranostics 2019; 9(1):196-209. doi:10.7150/thno.27550.