【多組學】Nature Plants：玉米瘋起來居然連自己都吃！

玉米，作為一種深受廣大人民群眾喜愛的食物，出現在了全國大部地區的餐桌上，主食亦可、做菜亦可、零食亦可……簡直就是居家旅行，必備食物。人們餓了吃玉米，玉米餓了吃什么呢？它真的會吃自己……

這不是個玩笑，在缺氮條件下，玉米會利用自噬來完成細胞質的回收再利用……近期發表于植物學頂級期刊《Nature Plants》（IF=11.471）的研究，利用多組學聯合的方式，在多個維度上分析了玉米自噬與缺氮脅迫的聯系。

和真菌、動物一樣，玉米的自噬操作也是由一系列ATG相關蛋白來共同參與完成的。而這次的研究，需要談論的是ATG8介導的自噬通路。ATG8是一個泛素樣蛋白，在ATG12-ATG5-ATG16這個E3樣酶的輔助下，與磷脂酰乙醇胺（PE）結合形成ATG8-PE復合體。ATG8-PE定位于自噬膜上，在自噬膜形成及與液泡的融合過程都扮演著十分重要的角色。

實驗材料

為了探討自噬如何通過ATG8相關途徑來影響玉米的細胞生理進程，研究者選用了自噬受損的atg12突變體atg12-1（無效等位基因）、atg12-2（基因敲減）與野生型（W22）作為實驗材料，在富氮、缺氮條件下進行培養。由于固氮效率和源-庫系統有著緊密聯系，研究團隊選擇了玉米幼苗的第二片葉和第四片葉分別作為取樣對象。因此，這個研究從轉錄組、蛋白組、代謝組和離子組等多個層面對比分析野生型和atg12突變體在（+/- N）條件下的差異，從而探討自噬對于細胞穩態的影響。

多組學研究中，往往會因為各個層面的結果較多，而在聯合分析上出現困難，那么我們來看看這篇文章是如何來處理這些數據的吧~

1. 缺氮脅迫與自噬缺失帶來的影響——材料的表型分析

在突變體材料獲得以后，首先要做的事情，當然是討論材料的表型差異，來證明自己選擇的材料具有代表性啦~

首先，研究人員在富氮條件下培養了2周后，在缺氮條件下培養了1周，讓玉米幼苗們經歷了吃飽又挨餓的過程（呃……它們真的還是孩子啊……）。玉米幼苗在經歷了大起大落以后，此時已處在了缺氮脅迫當中。此時，野生型玉米幼苗生長受到了明顯的抑制，而且已經出現了黃萎病的前兆。蛋白組和轉錄組的GO分析結果顯示，在缺氮條件下，氮代謝及其他響應缺氮脅迫的通路轉錄上調，而葉綠體組分的表達和積累被抑制。

那么突變體的表現如何呢？

首先，這兩種atg12突變體不能或不能很好地積累ATG8-PE，并表現出自噬缺失表型，如阻礙自噬體形成、對缺氮高度敏感、從源到庫的固氮能力較差等等。

果然，在沒有缺氮的情況下，atg12-1和atg12-2植株的第二葉ATG8蛋白水平在沒有氮脅迫的情況下顯著升高。這說明atg12突變對于ATG8蛋白的周轉產生了影響，也說明實驗材料選擇得很有針對性。而沒有了自噬的約束，突變體的蛋白總量積累增加，這也說明了自噬對蛋白總量維持在正常水平具有十分重要的作用。

在經過富氮-缺氮的歷程以后，它們和野生型的表型上出現了明顯的差異：與野生型相比，atg12-2和atg12-1的幼苗，隨著自噬缺失程度的增加，葉片黃變更明顯，葉片伸長更慢，葉綠素積累越少，葉片衰老越快。

2. 自噬對于代謝有哪些影響？——非靶向代謝組學分析

既然表型出現了明顯的變化，那么代謝水平是否發生改變，以及發生了哪種改變就很值得好好研究一下了。畢竟，代謝組是表型的靈魂畫師嘛~~此時，研究團隊對atg突變體和野生型進行了兩種處理。+N：在富氮條件下培養三周，-N：在富氮條件下培養了2周后，在缺氮條件下培養了1周，然后再分別取第二片葉和第四片葉。此后，他們利用LC-MS進行的非靶向代謝組學分析，比對六組處理的葉片代謝水平。結果顯示，第二和第四葉片中分別有218種和204種代謝產物的水平發生了顯著的變化，而這兩組差異代謝物有較高的重疊（約75%）。

讓研究團隊沒有想到的是，這些代謝變化在富氮條件下的植株中表現得更為強烈，這表明自噬即使在正常生長條件下也會對玉米代謝產生重大影響。而PCA分析結果也呈現了同樣的趨勢，缺氮脅迫和自噬突變對于葉片的代謝有著不同的影響。這也說明了缺氮脅迫激活了自噬之外的其他分解代謝途徑，以幫助應對這一營養挑戰。

那么自噬對哪些代謝物影響最大呢？代謝網絡聚類分析顯示了atg12背景下影響最顯著的化合物集中于脂類和次生代謝物。雖然碳水化合物和氨基酸代謝沒有發生廣泛的變化，但芳香族氨基酸呈現出了顯著差異。

3. 代謝變化背后的分子機制——轉錄組分析

研究團隊預測，atg12突變體的代謝物變化是由基因表達和蛋白質組成的改變所支撐的，所以先對轉錄組進行了分析。atg12-1、atg12-2與野生型相比，分別有3082個和2426個轉錄本顯著變化，而這些差異呈現出了較高的相關性。與代謝組學數據類似，缺氮和atg12突變產生了明顯的影響，atg12-1受到的影響較atg12-2更大。

研究人員將在三種或是四種處理中均有差異的轉錄本，作為核心轉錄本進行功能分析（圖c白色數字標識）。結果表明，自噬突變體中蛋白酶和脂質代謝轉錄上調。

 

4. 代謝變化背后的分子機制——蛋白組分析

由于轉錄組只代表可能的機制，為了進一步進行功能分子水平的確認，研究者進一步進行了Label free蛋白質組分析。此次在第二片葉和第四片葉中分別鑒定到了3,327和3,801個蛋白。PCA分析顯示，不同氮素利用率和基因型的影響似乎不相關，氮脅迫和自噬對蛋白質組均有明顯的影響，而自噬對于蛋白組的影響大于氮脅迫。

分析整體趨勢以后，研究人員進一步分析了基因型帶來的蛋白差異：在突變體與野生型之間，自噬的缺失使得大部分蛋白的豐度增加，GO結合差異分析顯示，許多細胞成分和生物過程的表達出現顯著差異，如光合作用、過氧化物酶體、ER等。而在缺氮條件下，線粒體、過氧化物酶體、ER等相關蛋白也表現出了顯著差異，但差異程度要小于自噬的影響。 

5. 缺氮脅迫下自噬及轉錄不同的影響——蛋白組+轉錄組對比與聯合

通過觀察突變體在富氮與缺氮條件下的蛋白變化，可以幫助我們獲得三方面信息：自噬缺失帶來的差異，轉錄翻譯（合成）帶來的差異，以及兩者共同帶來的差異。研究團隊基于這個目的，進行了蛋白組學數據和轉錄組數據進行了聯合分析。2729個蛋白和轉錄本被關聯，其中有52%在mRNA和/或蛋白水平差異顯著。相關性分析顯示，大多數僅在蛋白豐度上發生了顯著的變化，這說明atg12-1突變體中大多數蛋白的升高與轉錄翻譯無關。

GO聯合分析結果顯示，苯基丙酮和氨基酸代謝過程在轉錄和蛋白水平上都呈現了顯著上調，這與代謝組獲得的結果一致。atg12-1葉片中蛋白質水平的升高可能是由抑制自噬清除導致。值得注意的是，這些豐度增加的蛋白主要是過氧化物酶體，高爾基體、細胞溶膠、內質網、蛋白酶體及脂肪酸和蛋白質分解代謝等相關蛋白，其中一些是自噬的作用對象。在atg12-1葉片中，有兩類蛋白酶僅mRNA含量升高，而類囊體和液泡相關蛋白則在蛋白水平有差異，而mRNA水平并無顯著變化。類囊體的富集和葉綠體加速分解的現象共同說明在自噬缺失的情況下，有可能激活了其他驅動分解代謝途徑。

而通過結合蛋白和轉錄的結果，研究人員進一步發現在苯丙代謝和谷胱甘肽轉移酶活性相關的蛋白質和mRNA呈正相關，這著這些通路及其相關代謝物（至少部分）由合成驅動，可能是植株對脅迫的響應。而過氧化物酶體脂肪酸分解代謝和蛋白酶體相關蛋白的豐度變化則更多地受到自噬的影響，這與其他團隊的研究結果一致。同時，突變體中參與脂肪酸β氧化的過氧化物酶增加，并沒有導致脂肪酸水平下降，反而存在脂肪酸和脂質分解產物的大量積累的現象，這種不一致的很有可能是由于自噬受損導致的。

在討論組學結果時，必不可少的就是驗證。研究團隊分別使用RT-qPCR和免疫印跡在轉錄和蛋白水平上了進行數據驗證。結果顯示，在缺氮脅迫條件下，自噬的周轉會加速。而對于ATG相關轉錄本的檢測結果顯示，自噬受到抑制時，會在轉錄層面上激活相關通路。而對應蛋白的豐度主要受自噬周轉的影響。

6. 自噬調控代謝通路的系統畫像——結果總結

在做完各個組學的分析以后，研究團隊將代謝物、蛋白質和/或轉錄本豐度的變化疊加到代謝途徑圖上，對自噬調控代謝進行系統的描繪，重點關注了脂類代謝、脂肪酸β氧化以及部分次生代謝途徑。（這種簡化的通路畫像往往可以給文章錦上添花~~~知識點哦，朋友們！）

最終的結論是，自噬在富氮生長條件下也能顯著改變玉米蛋白質組，并強烈改變葉片代謝，尤其是在膜周轉率和隨后的脂質分解以及次生產物積累方面。多組學分析有助于系統識別自噬與植物代謝之間的聯系，今后可以在實際農業生產中，用于調節作物中脂類、油脂、抗氧化劑、次生代謝產物和蛋白質的含量。

小編心得

這篇文章使用同樣的樣本對玉米代謝組、轉錄組、離子組和蛋白質組進行深入的、非靶向的分析，并結合核心自噬調控因子（ATG12）的突變體，來探討自噬是如何更廣泛地影響植物代謝的。在這個研究中，小編get到了以下幾點：

1. 使用相同的樣本，有助于尋找多組學數據集之間的可靠聯系。

2. 各個組學數據，各司其職，有機整合：代謝組數據描述表型變化；轉錄和蛋白數據聯合分析探討機制（本文的結果再次表明，兩者不一致性非常高），重點關注發生變化的相關代謝通路所涉及的基因和蛋白，作為代謝組數據的有效支撐。

3. 多組學聯合分析的方法與角度：（1）趨勢分析：PCA從整體上直觀反映出多個組學層面的趨勢異同；相關性分析對轉錄+蛋白的差異數據進行有效分類，分門別類地探討各種趨勢數據所攜帶信息。（2）機制調控分析：代謝通路圖將代謝物、蛋白質和/或轉錄本豐度的變化疊加在一起，以直觀明了的形式凸顯了此次研究的重點。

4. 對于涉及到交叉對比的數據分析，往往需要明確差異所代表的信息，才能夠更好地解讀海量數據背后的信息。還是那句話，數據分析的靈魂來自于有趣的研究思路~~~
 

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