【干貨】流式細胞術原理與應用詳解
流式細胞術
流式細胞術（flow cytometry，FCM）是利用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀態中的細胞或生物顆粒同時進行多參數、快速定量分析和分選的高新技術。其特點是:第一，只要樣本制備成單個細胞或生物顆粒懸液均可以分析。第二，測量速度快，每秒中可以測量數千個乃至數萬個細胞。第三，同時測量每個細胞的多參數特征。第四，在進行細胞特征分析的同時可以把指定特征的細胞分離出來，以便對特定細胞做進一步培養、克隆化、觀察或進行某些實驗，這就是分選技術。
那么，具體是如何通過FCM實現分選的呢？
1、首先，制備單細胞懸液
將待測細胞或微粒制成單細胞懸液，經特異性熒光染料標記抗體進行染色，在恒定氣體的壓力下進入流動室，不含細胞或微粒的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流形成一定角度，鞘液包繞著樣品高速流動，組成一個圓柱形的液流束，待測細胞或微粒在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。
2、其次，收集單細胞上的熒光信號
流式細胞儀通常以激光作為發光源，經過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，細胞或微粒上的熒光染料被激發，產生散射光和激發熒光。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。
3、再次，統計結果
熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原強度或細胞內物質的濃度，經光電轉換變為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示在計算機上。
4、最后，做細胞分選
細胞的分選是指根據所測定的各個參數將指定的細胞從細胞群體中分離出來的一種方式，通過分離含有單細胞的液滴實現。在流動室的噴口上方配有一個超高頻的壓電晶體，產生的振動使噴出的液流形成均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離[1]。
流式細胞術動用了現代多科高技術，能夠同時定量檢測檢測單個細胞的多項指示，顯示出無比優越性，已經廣泛應用于細胞生物學、免疫學、臨床醫學、基礎科學研究、海洋生物以及分選應用等研究領域。
這么高級的單細胞統計儀器，到底能做哪些實驗呢？
比如，細胞計數標記可以幫助分析細胞，我們以此為例說明流式細胞儀的應用。
圖2、流式檢測B-NDG小鼠血液和脾臟細胞中NK細胞比例
如圖，一個點表示一個細胞，縱坐標表示熒光散射，將細胞分散開；橫坐標表示熒光強度，熒光強度越強，結合的抗體越多，表達的NKp46越多，說明該表達Nkp46的細胞群為NK細胞。結果顯示： 在C57BL/6小鼠的脾臟和血液中均可檢測到NKp46的表達；在B-NDG小鼠中未檢測到NKp46的表達，表明B-NDG小鼠中沒有NK細胞。
T細胞、B細胞和NK細胞的檢測
圖3、B-NDG®小鼠的T 、B和NK細胞的完全缺失[3]
取BALB/c、NOD-scid和B-NDG小鼠的外周血細胞，并通過流式對比其中T 、B和NK細胞的組成（A）并進行統計對比（B）。圖3A橫坐標/縱坐標都表示熒光強度，熒光強度越強，抗體表達量越多，則表達這些marker的相應細胞存在。B-NDG小鼠CD3、CD19和NKp46的相對應區域沒有熒光，說明B-NDG小鼠中表達CD3、CD19和NKp46的成熟T,B和NK細胞不存在。結果：B-NDG®小鼠外周血中缺乏成熟的T細胞、B細胞和NK細胞。
好了，今天就到這里了，這些只是基本的流式細胞儀的分析原理和使用，流式細胞儀的使用可以更深更廣，想了解更多相關知識，請繼續關注我們吧！
參考資料：
[1]《流式細胞術原理與應用教程》
[2]http://www.flowlab-childrens-harvard.com/new_user
[3]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/52.html
