Genome Research丨lncRNA在精子發生過程中發揮重要作用

一直被很多科學家認為是真核生物基因組進化中“垃圾”信息的非編碼RNA（ncRNA），既不編碼蛋白質，又缺乏生物學功能的遺傳學證據，近幾年得到了“平反”，越來越多的研究表明ncRNA 在劑量補償效應(Dosage compensationeffect)、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮重要作用，成為遺傳學研究熱點。

隨著高通量測序技術發展，越來越多的lncRNA被證明在睪丸和腦組織中呈現高度特異性表達，這暗示著在精子發生與神經調控兩個基礎生命學過程中，lncRNA的功能機制具有代表性。 

清華大學高冠軍實驗室于2016年9月1號在Genome Research正式刊發題為《Critical roles of long noncoding RNAs in Drosophila spermatogenesis》的文章。此文章詳細闡述了lncRNA在精子發生過程中的重要作用，為揭示“暗物質lncRNA”具有重要生物學功能提供了大量的遺傳學證據。

高冠軍研究小組選擇基因強凈化的模式生物果蠅為代表，通過高通量遺傳動物模型的建立，鑒定了128個睪丸特異性表達的lncRNA。然后運用優化后的CRISPR技術建立了105個lncRNA基因敲除體。通過觀察并分析雄性果蠅精子發生、發育、活力等，發現近1/3的lncRNA基因的缺失會導致精子發育異常甚至完全不育。

圖1 剔除研究的睪丸特異性lncRNA的鑒定和選擇的流程圖。使用生物信息學和在FlyBase中注釋的lncRNA的分析的新型lncRNA組合以構建lncRNA起始庫。然后，通過睪丸特異性表達篩選和RNA原位雜交，選擇128種睪丸特異性lncRNA候選物用于靶向敲除。這些lncRNA位于三個不同的染色體上，包括染色體2的左臂和右臂，染色體3的左臂和右臂和染色體X。

圖2 lncRNA突變體導致雄性特異性生育缺陷。 （A）105個lncRNA突變體的生育概況。 （B）刪除lncRNA CR44455 / 6導致雄性不育，而CR44455 / 6 - / - 雌性完全能育。 （C）對CR42858 - / - 的雄性和雌性突變果蠅進行定性生育力測定。 刪除CR42858大大降低了雄性的生育力，但雌性不受影響。

而通過異位轉基因方法發現，lncRNAs敲除的果蠅可以完全或部分修復異常，表明這些lncRNAs主要以反式（trans）發揮作用。高冠軍小組還通過基因表達譜分析得出，大部分功能性lncRNAs在精子發生過程中調控全局基因的表達。進化分析表明，相比起編碼基因，lncRNAs演化更快，且具有更大功能重要性的lncRNAs具有較高的序列保守性，暗示它們處于不斷的進化選擇之下。與蛋白編碼基因的開關調控作用不同的是，lncRNA可能多通過微調的方式調控全局基因表達，從而影響雄性生殖細胞分化。

高冠軍小組的這個研究意義在于彌補了大量功能性lncRNA在動物活體水平所缺乏遺傳學證據的空白，開啟了lncRNA所傳遞的生命信息研究的大門。接下來為大家附上這篇文章的摘要。

摘要：

Long noncoding RNAs (lncRNAs), a recently discovered class of cellular RNAs, play important roles in the regulation of many cellular developmental processes. Although lncRNAs have been systematically identified in various systems, most of them have not been functionally characterized in vivo in animal models. In this study, we identified 128 testis-specific Drosophila lncRNAs and knocked out 105 of them using an optimized three-component CRISPR/Cas9 system. Among the lncRNA knockouts, 33 (31%) exhibited a partial or complete loss of male fertility, accompanied by visual developmental defects in late spermatogenesis. In addition, six knockouts were fully or partially rescued by transgenes in a trans configuration, indicating that those lncRNAs primarily work in trans. Furthermore, gene expression profiles for five lncRNA mutants revealed that testis-specific lncRNAs regulate global gene expression, orchestrating late male germ cell differentiation. Compared with coding genes, the testis-specific lncRNAs evolved much faster. Moreover, lncRNAs of greater functional importance exhibited higher sequence conservation, suggesting that they are under constant evolutionary selection. Collectively, our results reveal critical functions of rapidly evolving testis-specific lncRNAs in late Drosophila spermatogenesis.

高冠軍簡介：

高冠軍博士，清華大學生命科學學院 PI，博導。2005年6月獲浙江大學生物物理學博士學位。2011年至今被清華大學生命學院聘為PI和博士生導師。目前，通過運用實驗室在國際上率先建立的CRISPR與phiC31重組酶相結合的高效果蠅基因打靶系統（knock-out和knock-in），綜合運用遺傳與生化相結合的方法與技術，規模化研究染色質表觀遺傳學相關因子（如非編碼RNA及組蛋白修飾等）在生殖系統及胚胎早期發育進程中的生物學功能及相應的分子作用機制。研究成果多次發表在Nature、Genome Research、PNAS、EMBO J、Genetics、G3：Genes|Genomes|Genetics、Nature Microbiology等國際學術期刊上。

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