2003年人類基因組精細圖繪制完成，是人類科學史上一個里程碑式的事件。后基因組時代的研究重點自然落在了蛋白質頭上。為啥？因為中心法則告訴我們，基因的產物——蛋白質，是生命活動的最終執行者。與基因組類比，研究生物體內全套蛋白質的科學，就是蛋白質組學。基因組計劃完成的同年，人類蛋白質組計劃啟動，令人激動的是，2014年人類蛋白質組的草圖也完成了。而蛋白質組學能夠飛速發展的最大功臣非質譜莫屬。質譜的應用范圍非常廣泛，但這里只討論蛋白質組學中的質譜。

  簡單地說，質譜法（mass spectrometry）就是對肽段離子的重量（質荷比，m/z）進行測量的分析方法。樣品經質譜儀（mass spectrometer）檢測得到質譜圖（mass spectrum），通過對質譜圖的分析就可以對樣品中的蛋白進行鑒定、定量。親，圖1的這種典型的蛋白質組學流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特異性的酶（通常為Trypsin）切割為肽段，再進行后續分析，這在蛋白質組學中被稱為“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我們平時見到的質譜分析基本都是這種類型。提到蛋白質組，即會聯想到一系列高大上的名詞，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我們就來理理清楚。

圖1. 典型的蛋白質組學流程

  大體上，質譜研究蛋白主要是鑒定和定量。通過二級質譜圖（MS2或者MS/MS）進行數據庫搜索匹配鑒定蛋白。通過各種標記或非標記的手段對不同樣品中的蛋白進行比較就是定量。蛋白定量比較是質譜最重要的用途，圖2是對定量方法的一個簡單總結。非標定量（Label-free）不需要標記，不同樣品分別處理、分別進質譜檢測；優點是處理簡單、無需標記、價格便宜、可以比較很多組樣品，缺點是對操作步驟、LC、質譜穩定性要求嚴格。SILAC是在細胞培養基中加入穩定同位素標記的氨基酸，在代謝水平標記蛋白，一級質譜圖進行定量，可以做到三組樣品混合后進行比較，定量準確，但是不能標記組織樣本，養細胞成本也較貴。雙甲基化標記是通過化學反應的辦法在肽段水平進行標記，一級質譜定量，也可以三組對比，標記試劑都比較便宜，而且可以標記任何來源的樣品。iTRAQ和TMT是商品化的試劑盒，肽段水平標記，二級質譜定量；分別可以做到最多8組和10組樣品間蛋白質組的比較。

圖2. 質譜定量方法

以上這幾個是一家的，還有幾個名詞是屬于另外一家，比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRM^HR/PRM。質譜進行數據采集的方式大致分為三種：鳥槍法（Shotgun）、選擇反應監控（SRM）和全景式的SWATH/DIA。下面對照圖3再來簡單介紹一下。

圖3. 質譜掃描方式

  DDA、IDA、Shotgun和鳥槍法說的是相同的東西，意思是質譜在每個循環的中從一級里挑選豐度高的TopN個肽段去打碎做二級掃描，得到的結果通過與已知數據庫中的理論蛋白進行匹配。DDA簡單有效，分析流程比較成熟，也是目前質譜分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷，即具有一定的隨機性，偏向于檢測豐度較高的肽段，而抑制了低豐度肽段的檢測。

  靶向策略被稱為質譜領域的Western blot。質譜只去采集目標肽段大小的離子信息，因而提高了靈敏度和特異性。這種方法用來研究感興趣的特定蛋白，定量準確，但是通量很有限。

SWATH/DIA這種全景式的數據采集方式在最近幾年突然火了起來，被認為在不遠的未來可能會取代DDA的主流位置。該方法采取的策略是將掃描范圍內的所有肽段按照質荷比分為若干個窗口，再對每個窗口里所有的肽段一起打碎，采二級，數據分析時通過抽提蛋白的子離子信息進行定量。SWATH/DIA解決了DDA中隨機性選擇肽段的缺陷，所以重復性更好，定量的準確性基本達到了SRM的水平，而且可以實現大規模定量。

  借用聽來的一個比喻來說明：DDA就像機關槍掃射，數量多、體積大的目標命中的概率要大一些。靶向掃描（SRM或PRM）就像精準狙擊，排除干擾，目標明確，每一槍直指目標，但是難以大規模消滅敵人。SWATH/DIA就是地毯式轟炸，只要暴露在我方攻擊范圍內的敵人，不管三七二十一，全部炸完。

圖4. 定量方法與采集方式結合

  如果將上述的定量方法（圖2）和質譜數據采集方式（圖3）結合起來，就得到了現在基于質譜的蛋白質組學研究的各種策略（圖4）。再打個比方，保證吃貨們一聽就懂：雞、魚、肉、蛋、蔬菜要通過炒鍋、烤箱、高壓鍋、微波爐等烹調之后才能變為美食，填飽肚子。同樣的，各種定量方法（非標的和標記的）處理的樣品，要通過質譜各種采集方式變為電腦中的數據，才能分析并從中得到蛋白的信息。

  本次的介紹就先到這里了，如果其中有什么問題，歡迎您批評和建議，我們會努力變得更好；如果需要跟我們進行技術交流和討論，歡迎大家聯系武漢金開瑞。后續我們還會繼續推出對質譜技術各方面進行解析的文章，敬請期待。

References

1. A draft map of the human proteome. Nature 509: 575–581 (2014)
2. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582–587 (2014)
3. A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 273–99 (2011)
4. SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)
5. iTRAQ: Molecular & Cellular Proteomics 343: 91–99 (2010)
6. SRM: Nature Methods 9: 555–566 (2012)
7. SWATH: Molecular & Cellular Proteomics 11: 1–17 (2012)