Stem-loop實時定量RT PCR

傳統實時定量RT PCR只能檢測到miRNA前體，而Stem-loop實時定量RT PCR技術可以解決這一問題。Stem loop實時定量RT PCR是一項高特異度、敏感度的檢測miRNA表達的實驗技術，包括設計具有莖環（stem loop）結構的反轉錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針進行實時PCR 二個關鍵步驟。該技術具有以下優點:高度特異性，對序列高度同源的miRNA也可精確區分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度；樣品消耗少，僅需1～10 ng的總RNA；適用范圍廣，總RNA、細胞裂解物以及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測。

Stem-loop實時定量RT PCR基本原理： microRNA的RT-PCR一般使用莖環結構的引物，這種具有莖環結構的引物針對所需檢測的目的microRNA設計，具有特異的序列，結構示意圖如下所示。內參使用的是小RNA U6，U6的反轉錄使用的是隨機引物。將反轉錄的產物作為real-time PCR的模板，檢測目的microRNA的引物是針對目的microRNA的特異的上下游引物，檢測內參使用的是針對U6的特異的上下游引物。

實驗過程

1、用Trizol抽提total RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用異丙醇處理時需要4℃ 過夜。將抽提得到的RNA置于-80℃保存。

2、將抽提的RNA進行反轉錄。反轉錄的體系一般使用12.5ul的體系。具體的體系如下：

A: RNase free water

B: Total RNA: 0.625ug

C: Impron buffer: 2.5ul

D: dNTPs: 2.5ul

E: RNase inhibitor: 0.625ul

F: Impron Mgcl2: 1.5ul

G: Primer: 0.5ul

H：Reverse transcriptase: 0.625ul

具體的操作是事先計算好需要的模板量，以及所要的RNase free water的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量，并將剩下的模板立即置于－80℃保存。再按照反轉錄的體系做好總的MIX，再分裝到每個PCR小管內。將PCR小管置于PCR儀上反轉，反轉的具體程序如下： 25℃ 5 min ,42℃ 60 min ,70℃ 15 min. 4℃儲藏

3、    反轉錄的cDNA作為real-time PCR檢測的模板，由于real-time PCR檢測靈敏性，要求每個樣需要三個重復。每一個反應的用量如下：

1.                         SYBR 5.0ul

2.                         Primer mix 0.2ul

3.                         cDNA 1.0ul

4.                         water 3.8ul

4、在八連管中先加入模板，加入3.4ul的cDNA模板。

5、 根據需要檢測樣本的個數，計算所需要的SYBR、Primer mix、water量，具體的計算過程為：試劑單反應量X檢測樣本個數X3.4 ,根據計算需要的量制作MIX 。將MIX加入每個八連管的小管中。

6、    將對應的每個八連管的小管取出10ul加入96孔板，每個小管對應96孔板的3個孔，即3個重復孔。

7、  加完樣品后，用專用的封膜覆蓋96孔板，用專用的刮板覆蓋嚴實。

8、上機檢測。具體PCR程序如下：

1：50℃ 2 min ;

2：95℃ 5 min ;

3：95℃ 30 s ;

4：60℃ 40 s ;

5：72℃ 30 s ;

6：95℃ 15 s ; 60℃ 30s ;95℃ 15 s .</OL< ol>

實驗注意事項

1、由于real-time PCR的檢測十分靈敏，因此它對RNA定量的準確性要求較高，一般RNA的定量多采用3復孔定量。

2、    無論在反轉錄或real-time PCR加樣時要求加樣一定要準確。

3、    在將八連管的mix加入96孔板前一定要充分混勻，一般采取的策略是將八連管一剪為二，置于Vortex上振蕩混勻，Vortex的轉速不要太高，以免將管內的液體濺到蓋子內。

miRNA靶基因的鑒定

目前鑒定靶基因最直接的方法是, 利用熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測轉染或敲低miRNA后細胞中mRNA水平及蛋白水平的變化, 從而確定miRNA與靶基因的對應關系. 這種方法可以大大提高準確率，但最終確定靶基因，還需要鑒定miRNA的靶位點. 而miRNA的靶位點的鑒定最常用的方法是熒光素酶報告基因法. 其基本原理是首先構建熒光素酶表達載體, 將希望鑒定的miRNA靶基因的3?UTR構建到熒光素酶基因的3’UTR中, 然后將熒光素酶基因表達載體轉染細胞并改變細胞中相應miRNA的表達水平, 最后檢測熒光素酶的表達情況以分析轉染3’UTR中是否含有miRNA的靶位點。