微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。關(guān)于微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以動(dòng)物細(xì)胞為例，具體介紹如下：

 

微載體培養(yǎng)技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過三十余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。

 

微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。

 

使用較多的反應(yīng)器有兩種：貝朗公司的BioStatB反應(yīng)器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。

 

微載體是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一種微載體問世以來，國(guó)際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達(dá)十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

 

• 微載體的大小：增大單位體積內(nèi)表面積（S/F）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。

• 微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大。

• 微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。

 

1.原理：

其原理是將對(duì)細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。

 

貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

 

2.攪拌轉(zhuǎn)速：

由于動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。

 

3.細(xì)胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理PH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。

 

4.細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng) 影響細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)的因素很多，主要有三個(gè)方面：

• 在細(xì)胞方面，如細(xì)胞群體、狀態(tài)和類型。

• 在微載體方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。

• 在培養(yǎng)環(huán)境中，如培養(yǎng)基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件最優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之生長(zhǎng)速度慢。

 

5.微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)

• 培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的PH與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而非穩(wěn)定期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。

• 貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。

• 培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨意細(xì)胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。

• 收獲細(xì)胞：首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應(yīng)的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。

• 微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。

 

此技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括：細(xì)胞對(duì)剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)等。而研制的各種類型生物反應(yīng)器系統(tǒng)則可針對(duì)上述限制性因素，為微載體細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增提供低剪切力、高氧傳遞效率、易于細(xì)胞傳代等適宜的外部環(huán)境。

 

已較多使用的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應(yīng)器，可以實(shí)行計(jì)算機(jī)控制操作，培養(yǎng)攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、PH穩(wěn)定及溶氧供應(yīng)（O₂、N₂、CO₂、空氣四種純化氣體按比例調(diào)節(jié)）、罐壓、培養(yǎng)體積和通氣量等參數(shù)全部由電腦自動(dòng)控制。因此，應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行微載體細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增具有明顯優(yōu)勢(shì)，目前國(guó)外相繼研制了數(shù)種適合進(jìn)行微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)以及灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)等。

 

1.攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng) 

攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)在微載體細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增研究領(lǐng)域已有較長(zhǎng)的研究歷史，但因該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)容易產(chǎn)生過大的剪切力，從而限制了其應(yīng)用范圍。盡管如此，由于該系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、實(shí)用及價(jià)格低廉等特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外仍有不少應(yīng)用該系統(tǒng)成功進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的研究報(bào)道。例如，Werner A（2000年）成功地在該系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行了肝細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的研究。

 

2.灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng) 

灌流培養(yǎng)是目前研究熱點(diǎn)之一。它的特點(diǎn)是不斷地加入新鮮培養(yǎng)基以及不斷地抽走含細(xì)胞代謝廢物的消耗培養(yǎng)基，使細(xì)胞得以在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)增殖，即省時(shí)省力，又減少了細(xì)胞發(fā)生污染的機(jī)會(huì)，且可以提高細(xì)胞密度10倍以上。

 

3.旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 

近年來，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器系統(tǒng)（RCCS）已經(jīng)成為應(yīng)用微載體技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的一種較常用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于美國(guó)航空航天局為模擬空間微重力效應(yīng)而設(shè)計(jì)的一種生物反應(yīng)器。RCCS既可以用于微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，又能在其內(nèi)培育細(xì)胞與支架形成的三維空間復(fù)合體。至今，近百種組織細(xì)胞均在該系統(tǒng)內(nèi)成功進(jìn)行了大規(guī)模擴(kuò)增。

 

• 表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；

• 把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；

• 可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況；

• 簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好；

• 培養(yǎng)基利用率較高；

• 放大容易；

• 細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜；

• 勞動(dòng)強(qiáng)度小；

• 培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。