甲基化檢測——MS-HRM技術
HRM技術服務之甲基化檢測（MS-HRM技術）
DNA甲基化是發生在DNA堿基序列上的一種共價修飾。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在5'-CpG-3'雙核苷酸序列的胞嘧啶上。在人類基因組中，大約有60%～70%的CpG胞嘧啶是甲基化的，其程度因不同的物種和細胞類型而異。DNA甲基化狀態在基因組中呈現出一定的分布模式，90％的甲基胞嘧啶位于重復序列上。DNA甲基化可以遺傳，并改變了DNA的結構特性與基因活動方式。
DNA甲基化意義：
靶序列上甲基基團的存在可以影響轉錄因子的結合，引起轉錄抑制，從而使該基因表達受到抑制。啟動子區CPG島的甲基化常常可以抑制該基因的轉錄，尤其是對于抑癌基因，凋亡相關基因，DNA修復基因等，啟動子區域發生甲基化會影響功能的發揮。不同的腫瘤組織基因甲基化狀態不一樣，可以作為早期檢測，監測腫瘤形成的重要標志物。對于某些特異基因的甲基化，更加重要，如DNA修復基因，可以引起對化療藥物的敏感，從而作為藥物治療療效的評價指標，指導臨床用藥。
檢測方法：
甲基化特異性PCR、Northern印跡法、Western印跡法、免疫細胞化學等，這些檢測方法需要花費大量時間，成本高，在臨床推廣應用時均存在一定的困難。
高分辨率熔解（High Resolution Melt,HRM）是一種最新的在表觀遺傳學中檢測 CpG 位點的一種新技術，主要是根據DNA序列的長度、GC含量、堿基互補性差異和特定飽和染料可以插入DNA雙鏈中的特性,應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，其分辨精度可以達到對單個堿基差異的區分。
作為新一代的遺傳掃描工具，HRM具有“簡、效、快、廉”等其它技術難以比擬的優勢：
簡：無需序列特異性探針，不受堿基位點局限，同時檢出已知或未知突變、SNP和甲基化位點；閉管操作，避免交叉污染。
效：最低檢測0.1%-0.01%的突變或異常甲基化，檢測SNP靈敏度和特異性均為100%。
快：1次同時檢測不多于384個樣本，在60-90分鐘內完成檢測。
廉：簡化操作步驟、降低人工和試劑成本，費用遠少于測序、Taqman探針等方法。
HRM技術特別適用于樣本量多、檢測位點較少的SNP、突變或甲基化分析，是不同于基因芯片檢測方法（檢測位點多，樣本少）的高通量方法。同時，也是基因芯片篩選后的多個基因在更多標本中驗證的最佳方法。
DNA甲基化-HRM檢測原理：
甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析（MS-High Resolution Melting Curve Analyse）是一種不需要 PCR 產物后續操作的，簡單且靈敏的檢測基因甲基化水平的方法。該方法主要通過比較曲線的熔解溫度和峰形得以實現并且可以在一些列的 CpG 位點中檢測出單一的一個甲基化的發生，同時，也可以對一系列的 CpG 位點的甲基化水平進行分析。單個 CpG 位點的甲基化和平均的甲基化水平會對熔解曲線的形狀造成影響。采用重亞硫酸鹽處理 DNA 模板可以使 5-甲基胞嘧啶轉化為尿嘧啶。在PCR反應前，在非CpG島位置設計一對針對經亞硫酸氫鈉處理后DNA 鏈的引物，這對引物中間包含有意義的甲基化CpG島，一旦這些CpG島發生甲基化，使胞嘧啶（C）不發生變化，而與未甲基化的胞嘧啶（C）轉變成胸腺嘧啶（T），樣品中的 GC 含量發生了變化，最終被轉化成了熔解曲線 Tm 值之間的差異。 CpG 位點在小的擴增片段內的相對位置也會對熔解峰的形狀產生影響，因此， 根據Tm值和熔解峰的形狀可以檢測出樣本的甲基化位點和甲基化程度。
HRM方法操作簡單、靈敏高、重復性高、成本低、不受檢測位點的局限高度等等優勢，將對于遺傳學、腫瘤學等方面的研究和臨床應用提供更大的幫助。
