正常人臍靜脈內皮細胞的培養

    實驗材料：

1. 嬰兒臍帶；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 培養用液：M199培養液（含20%小牛血清）；0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA（1:1，V：V）混合消化液；D-Hanks液、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；

4. 培養器具：玻璃插管與輸液膠管，培養瓶或皿、白內障、眼科剪、鑷子等；

培養方法：

1． 在無菌條件下，取健康產婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶（長20cm以上，不宜超過6h），選擇無夾痕、無扭曲、無凝血阻塞的部分；

2． 在臍靜脈兩端開口處，分別用絲線扎緊并固定在50ml注射器和帶輸液膠管的玻璃插管上，注入D-Hanks液沖洗臍靜脈，至無血跡；

3． 用止血鉗夾住玻璃插管上的輸液膠管，從另一端的注射器向臍靜脈徐徐注入0.1%膠原酶溶液，至血管充盈。注意兩端封閉，以防液體返流。立即放入37℃的無菌D-Hanks液內，15min后取出；

4． 通過注射器吸取收集酶液，同時注入含20%小牛血清的M199培養液沖洗靜脈，合并于同一離心管內，以1000r/min離心7—10min；

5． 棄去離心沉淀后的上清液。加入20%小牛血清的M199培養液（pH7.2），重新懸浮細胞。并調整至細胞密度為1.5×105—2.0×105個/ml，接種于培養瓶或培養皿中。置37℃,5%CO2培養箱培養；

6． 第二天棄培養液，用D-Hanks液輕輕洗1次，以去除不貼壁的細胞或死細胞。換入新鮮含20%小牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的M199培養液（pH7.2）。繼續置37℃,5%CO2培養箱培養；

7． 每2—3d換培養液1次。換液時將原培養液棄掉1/2—2/3，然后加入新鮮的上述培養液至原來的量。待細胞長至融合狀態后，即可行傳代培養；