---------旭月（北京）科技有限公司 供稿

非損傷性掃描離子選擇電極技術及其在后基因組時代的應用

許越^1,2,3) Joseph G. Kunkel³⁾ Alan Shipley⁴⁾ 張平⁵⁾ 王世強⁶⁾

張旭家⁷⁾ 何奕昆⁸⁾ 印莉萍⁸⁾ 楊黃恬⁹⁾ 上官宇¹⁾ 葉鑫生¹⁰⁾

( ¹⁾美國揚格公司，YoungerUSA Company, P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA

²⁾Department of Botany, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695 USA

³⁾Vibrating Probe Facility, University of Massachusetts, Amherst, MA 01003 USA

⁴⁾Applicable Electronics Inc., P.O. Box 589, Forestdale, MA 02644 USA

⁵⁾Department of Physiology, Yale University, New Haven, CT 06520 USA

⁶⁾北京大學生命科學學院，生理學與生物物理學系/生物膜與生物工程國家重點實驗室，

北京 100871

⁷⁾中國科學院生物物理所，生物大分子國家重點實驗室，北京 100101

⁸⁾首都師范大學，生命科學學院， 北京 100037

⁹⁾中國科學院上海生命科學研究院/上海第二醫科大學健康科學研究所, 上海 200025

¹⁰⁾國家自然科學基金委員會，生命科學部，北京 100085 )

摘要 非損傷性掃描離子選擇電極技術(Scanning Ion-selective Electrode Technique: SIET‘讀音:斯愛特’)在不接觸被測生物樣品－即：在保持被測生物醫學樣品完整和近乎實際生理環境的狀態下，獲得進出樣品的各種分子和離子的信息。該技術不僅能夠測量離子及分子靜止狀態下的絕對濃度，而且還可以測量它們進出生物樣品的運動速率及運動方向。SIET可以圍繞被測的單個或多個細胞、組織甚至器官進行靈活、方便而準確的立體測量并獲得被測物體周圍的離子或分子的三維立體數據。目前，SIET不但可以測量H⁺,Ca²⁺,K⁺,Al³⁺,K⁺,Cd²⁺,Cl^－和O₂，CO₂，NO及溫度等參數，而且可以同時采集多種離子及參數，為獲得生物樣品外分子或離子運動的有關信息提供了良好的實驗平臺。

關鍵詞 非損傷性電生理技術,離子選擇性電極,離子跨膜運輸,SIET

中圖分類號 Q2, Q6, R3, R4, R9, S1, TB37, X8
　

通訊聯系人. Yue (Jeff) Xu, YoungerUSA Co., P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA

E-mail: jeff@youngerusa.com
　

1. 前言
基因組研究后期所面臨的一個挑戰就是如何理解和確認那些未知的或者人工表達的蛋白質功能，特別是細胞質膜上的離子的運輸載體本身的研究，以及由這些蛋白質所產生的眾多信息是如何被細胞正確地整合到一起的？非損傷性掃描離子選擇電極技術(Scanning IonSelective Electrode Technique: SIET‘讀音: 斯愛特’)作為一個綜合性較強電生理技術成為迎接這一挑戰的理想工具。

SIET技術的核心是離子和分子選擇性微電極(以下簡稱：離子電極)(見圖1a)，由Kühtreiber和 Jaffe在1990年設計的一套由計算機控制的自動定位測量系統演變發展而成^[1]。其中Kunkel，Shipley和Karplus于1996年在計算機控制、信號放大和三維測量方面做了較大的改進，并將其定名為SIET。由于SIET能夠以非損傷的方式測量到進出生物材料的離子以及分子的運動速率，并隨著離子/分子電極種類的不斷增多以及電子線路技術和計算機硬件軟件的逐步完善，SIET逐漸被應用到基礎生物學、生理學、神經生物學、空間生物學、臨床醫學、基礎醫學、病理學、毒理學、營養學、農林學及藥物機理研究等領域。

盡管，人們通過膜電壓的測量，膜片鉗技術 ^[2,3,4]，及與顯微技術相結合的熒光感染料技術的應用，獲得了一些有關離子分布和運動的情況，但是，SIET技術作為對上述幾項技術的一項重要補充，并以其特有的時間和空間分辨率，為鑒定或驗證某些生物膜運輸系統的功能提供了非常有力的工具(見圖1b)。在這篇綜述里，我們將介紹SIET的基本原理、方法、局限性及其在各個研究領域中的應用狀況。

Fig.1 Ion-selective electrode and temporal / spatial resolutions of SIET.

圖1離子選擇性電極和SIET時間和空間分辨率分布。

(a)Ca²⁺電極的顯微照片，LIX(Liquid Ion Excahnger液體離子交換劑)；(b)SIET作為一個開放式的實驗平臺，在生物醫學研究過程中，較好的填補了整體組織研究過程中通過較慢的化學痕量方法(B)，與較快的通過染料標記或膜片鉗等局部研究方法(A)兩者之間的技術空白。
2. SIET原理
2.1. 物理學及數學基礎
物質在液體環境中有從高濃度到低濃度擴散的趨勢。對于帶電粒子而言，還有從高電化學電勢到低的電化學電勢運動的趨勢。如果，離子電極的移動距離dx在幾十微米以下，生物材料實驗證明，影響帶電粒子運動的電化學電勢的梯度可以忽略不計，那么，該離子的擴散運動速率可以通過Fick第一擴散定律計算出來(見圖2)。為方便理解，讀者可到美國揚格公司網站觀賞SIET原理電影動畫 (http://www.youngerusa.com/movies/SIET/)。

Fig.2 Physics and mathematic theory of SIET using Ca²⁺ diffusion gradient and Ca²⁺ selective microelectrode as examples.

圖2 以Ca²⁺濃度梯度和Ca²⁺電極為例說明SIET的物理學及數學原理。

離子選擇性電極由玻璃微電極，Ag/AgCl導線，電解質(100mM CaCl₂)及液態離子交換劑(LIX)四部分組成。該電極在待測離子濃度梯度中以已知距離dx進行兩點測量，并分別獲得電壓V₁和V₂。兩點間的濃度差dc則可以從V₁，V₂及已知的該電極的電壓/濃度校正曲線計算獲得。D是離子/分子特異的擴散常數(單位:cm^-2 sec^-1)，將它們代入Fick的第一擴散定律公式： J_o = - D dC/dx ，可獲得該離子的移動速率(單位：pmol cm^-2 sec^-1)，即：每一秒鐘通過一個平方厘米的該離子/分子摩爾數 。
2.2. 電子學
SIET系統同時向用戶提供兩種前置放大器，極譜前置放大器和電壓前置放大器(見圖3)。極譜前置放大器是配合金屬電極的一種前置放大器，如鉻白金合金電極(用于測量O₂和H₂O₂等)或碳絲電極(用于測量NO等)，有關金屬和碳絲電極的制作和工作原理將在未來的SPET(讀音:”斯派特”。SPET:Scanning Polarographic Electrode Technique)技術綜述中加以介紹。電壓前置放大器是用來配合本文詳細介紹的離子選擇性電極^[5]。盡管兩種放大器所使用的電極及其工作原理不同，但它們測量分子和離子流動速率的原理和方法是相同的。因此，它們可以共享后續的電子電路以及計算機軟件系統。值得一提的是，SIET系統具有兩個放大器通道，可以將極譜前置放大器和電壓前置放大器進行任意形式的組合并進行同時測量，在SIET的應用部分(3.1)將舉例介紹如何利用這一優勢對生物材料進行O₂(利用極譜前置放大器)和H⁺(利用電壓前置放大器)的同時測量。

Fig.3 Polarigraphic pre-amplifier and voltage pre-amplifier of SIET system.

圖3 SIET系統極譜前置放大器和電壓前置放大器電子線路簡圖。
2.3. 離子電極的靈敏度及時間分辨率
2.3.1.靈敏度
如同其他任何電生理技術一樣，SIET的最終靈敏度還是要取決于電極尖端LIX的高阻抗而產生的熱力學電子噪音(Johnson噪音)。SIET通過大于10赫茲的采樣頻率和1到10秒內的數字化平均值來降低系統噪音,使SIET的靈敏度能夠接近理論極限^[6]。

2.3.2.時間分辨率
如圖2所示，離子選擇電極在V₁和V₂位置停留的時間通常為1到10秒，而且測得離子流動速率J_o至少需要測量兩點的數據，決定了SIET技術的時間分辨率。另外的原因還包括：

a) 如果離子電極移動過快將使被測樣品周圍的溶液受到干擾而破壞離子梯度。電極的移動大致要占去一個測量周期的10%到20%。因此，如果被測離子梯度較大的話，可以通過縮短dx來提高SIET的時間分辨率。

b) LIX需要一定的時間穩定下來，否則，它的測量效率將受到影響，最終導致實驗數據的不準確。

2.4. 計算機技術及系統集成
SIET的誕生，發展與完善與計算機技術的不斷進步是密不可分的。盡管，計算機需要同時控制三維運動系統，顯微成像系統和信號放大系統三個子系統(見圖4)，但由于離子選擇電極相對較低的時間分辨率要求(2.4.2)，使得普通的個人電腦也可以完全勝任。這為SIET的普及和發展提供了很好的現實基礎。

Fig.4 Schematic diagram of SIET system.

圖4 SIET系統組成。

(a)組成SIET系統的三大亞系統；(b)SIET系統分解圖。

2.5. 影響SIET正確使用的主要外部因素 2.5.1.緩沖溶液中離子流動速率的測量
在使用SIET技術過程中，通常要在溶液中加入一些緩沖劑成份，如：MES，Tris或EDTA等，用以穩定被測離子以便離子選擇電極進行測量。然而，如果離子緩沖劑選擇或者使用不當，被測離子會與緩沖劑相互干擾，破壞被測離子的濃度梯度或者被大幅度壓縮，從而嚴重影響到SIET的應用效果。Kunkel等人通過系統地比較試驗，尋找到了一些最適合于SIET技術的溶液pH緩沖劑及其使用方法，并以實際生物材料的研究證明通過使用這些方法可以將SIET測知離子流動速率的能力達到最大化^[8]。因此，在SIET試驗設計過程中，不但要考慮到測量溶液中各種成份對被測樣品生物活性的影響，還要充分考慮到緩沖劑成份對被測離子梯度的作用以及對LIX有無嚴重干擾。

2.5.2.空間幾何構型的影響
在現有的1-2微米直徑的離子電極，電極距被測材料2-20微米及dx在5-30微米的技術條件下，被測材料離子流動的空間幾何分布可以大致分為三類：點，平面及球體。在離子電極距被測材料小于5微米時，通常認為離子是以平面方式運動。

值得一提的是，SIET是目前世界上唯一能夠按照研究人員的設定，以手動或編程的方式，用任意角度(相對于被測物體表面)用離子選擇電極對被測樣品進行測量的系統。經典的利用SIET靈活的空間測量方式的例子是，Kunkel等人對植物花粉管生長過程中，尖端Ca²⁺內流的研究。他們不但能夠測量出Ca²⁺的內流速率，而且還計算出該花粉管尖端一個圓盤式的結構是Ca²⁺進入區域的形狀(見圖5) ^[8]。

Fig.5 Spatial structure was determined by the 3D data collected from SIET (based on [8], 1999).

圖5 SIET系統強大的空間測量方式幫助Kunkel等人推斷離子進出的空間構型(根據文獻[8]的圖修改)。

(a)NOD因子引發較對照多一倍的Ca²⁺內流；(b)由于采取特殊的空間測量方式，所測的得離子流動方式證明Ca²⁺內流的區域是一個圓盤狀。

2.6. SIET的數據分析
自從SIET誕生以來，在數據分析方面一直是其較為薄弱的環節，在一定程度上也制約了SIET的推廣和應用。這主要是由于各個實驗室在離子電極的制作、電極的校正、電極的測量效率、電極相對于被測材料的位置、電極的運動方式定義以及緩沖溶液成份方面存在著或多或少的差異。而且，即使在同一實驗室，由于某一因素的改變就將對最后的結果產生影響，從而很容易在數據分析上造成偏差，甚至錯誤^[9]。

許越等人針對上述問題，最近在SIET數據分析標準化方面做了一些嘗試(見圖6)^[10],并設計了一套Internet多用戶共享的數據分析軟件-MageFlux(http://youngerusa.com/mageflux)。

Fig.6 MageFlux: Web-interfaced SIET data analyses and 3D display software (based on [10], 2005).

圖6.SIET數據分析標準化網上數據分析軟件MageFlux-項目建立頁面(根據文獻[10]的圖修改)。

(a)項目名稱及說明；(b)電極相對于被測材料的空間位置；(c)以顯示器為基準，電極的3維運動方向符號的選擇以及電壓差的計算方式；(d)不同離子電極的一些固有常數，如：離子擴散系數D₀，離子電極測量效率eff，以及隨試驗不同而有所變化的部分，如：測量濃度梯度兩點間的距離dr(圖2中的dx)，通過電極靜態校正獲得的斜率(Slope)和截距(Intercept)。
MageFlux通過將試驗參數利用計算機軟件進行跟蹤和管理，不但將SIET數據的分析過程標準化，而且還可以將數據以三維動態交互式的形式展現在科研人員面前，真正將SIET技術的空間靈活測量方式體現了出來，并且為離子流動進出被測材料的精確定位提供了最直接和形象的依據。

3. SIET的應用
近年來，SIET為在生命科學各個方面的深入研究提供了一個嶄新的工具。在揚格公司的網站(http://youngerusa.com/en/publications/siet.php)有較為全面的文獻可供檢索。鑒于本綜述目的在于介紹SIET技術，應用SIET進行的具體科學研究請見相應的文獻。在這里我們將重點介紹SIET技術應用的各個方面。讀者還可以到揚格公司網址(http://youngerusa.com/NY/chinese/basics/04sanya_talk.php)，收看許越在2004年全國生物膜與重大疾病學術討論會上有關SIET演講的實況錄像。

3.1. 植物生理學
SIET在植物學研究中的應用，在該技術的誕生以及發展過程中始終占有相當大的比例。這可能與植物細胞外的細胞壁對向膜片鉗這樣的技術來講操作較為困難有關。而利用SIET特有的非損傷性特點，可以在不對細胞、組織甚至器官造成任何損傷的情況下測知離子分子的運輸情況。正是意識到SIET的這一優勢， Kochian等人在原有的Ca²⁺選擇電極的基礎上，又相繼開發出了H⁺，K⁺，Al³⁺和Cd²⁺離子選擇性電極，并將其應用于玉米根和植物毒理學的研究，并為這些電極在動物研究中的應用開辟了道路 ^[6,11,12]。隨后，SIET技術被應用于整體根、根毛及花粉管的研究，闡明了諸如鈣離子運輸與樣品內部活動及生長的相關性^[8,13-17]。Messerli等人與1999年的出色SIET應用，將脈動式的花粉管生長所體現的周期，與離子流動速率表現出的頻率相互聯系了起來^[18]。

圖7是許越等人應用SIET特有的多電極同時測量功能，研究H⁺和O₂在百合花粉管生長過程中的變化(文章準備中)。

Fig.7 Simultaneous measurement of H⁺/O₂ fluxes.

圖7 H⁺和O₂流動速率的同時測量。

(a)顯微照片顯示金屬氧電極與玻璃H⁺電極同時測量百合花粉管生長過程中H⁺和O₂進出的變化；(b)在花粉管線粒體密集區域, 或稱固有堿化帶(Constitutive Alkaline Band)區域，同時存在的H⁺外流和O₂內流。

3.2. 哺乳動物發育生物學
對于哺乳動物受精卵及胚胎的研究充分體現了SIET的非損傷性技術優勢，即：SIET不但可以測知離子運輸的基礎生理學過程，以幫助我們認識生物發育過程中動態的離子調控機制，而且還可以作為器官移植前器官功能的檢測工具。該檢測是依據凍融兩細胞階段老鼠胚胎的Ca²⁺流動速率與隨后的胚胎形態變化及發育是密切相關的研究結果^[19,20]。Trimarchi等人對老鼠blastocyts做一個生理狀況檢查，首先監測Ca²⁺的流動情況，隨后把它移植到一個假孕受體里。9天后，12個測試過的blastocyts產生出了11只健康的老鼠。(見圖8)^[21].

ig.8 Application of SIET generates little effects on blastocysts and development afterwards (based on [21],2000).

圖8 應用SIET技術測量blastocysts對于它們的后續發育并無影響(根據文獻[21]的圖修改)。

(a)blastocyst周圍Ca²⁺速率的測量。內插圖: Ca²⁺電極與被測胚胎細胞；(b)新出生的黑色幼鼠(B6C3F1)。這些幼鼠在blastocyst階段經過SIET技術測量后被移植到假性懷孕的白鼠體中.
3.3. 生理學
肌肉可以產生運動的特性使得許多生理學技術，特別是需要插入細胞內的電極技術，對于它們都一籌莫展。可喜的是，SIET技術的非損傷性，為其在研究肌肉運動中的緩慢過程提供了用武之地。Pelc et al.利用SIET技術測量到了 (Mytilus edulis ，一種軟體動物) 平滑肌在carbachol刺激下收縮時大量的Ca²⁺內流。其值高達80 pmolcm^-2s^-1 而且是在 1 mMCa²⁺背景濃度的條件下測得的 ^[22]。Pelc et al.還成功的從單個離體的肌細胞myocytes測量到了Ca²⁺流動 ^[23]。

在Leah Devlin等人的研究中較容易地測量到了Sclerodactyla briareus (Sclerodactyla briareus 是一種海參，它名字是不慌不忙的意思)平滑肌在神經介質和激素刺激的下產生的Ca²⁺外流(見圖9)^[24-26]。

Fig.9 Ca²⁺ effluxes with neural transmitter and hormone (based on [26], 2003).

圖9平滑肌在神經介質和激素刺激的下的Ca²⁺外流變化(根據文獻[26]的圖修改)。

(a) Muscarinic AchR antagonists (10–6 M) himbacine (M2,4)對Ca²⁺ 外流的促進作用。M in ASW：肌肉自發的Ca²⁺ 流動,ASW(artificial Ca²⁺-free seawater); M in himbacine：在himbacine誘導下的Ca²⁺ 流動；背景信號 (BG): Ca²⁺離開材料500微米所取得的信號。(b) The Ca²⁺ release agonists, caffeine(10–6 M) 對Ca²⁺流動的影響。
應該指出的是，在諸如verapamil和diltiazem(L-type channels) Co²⁺and La³⁺ 拮抗劑不存在情況下，SIET測量不到Ca²⁺ 速率信號變化。

這一點在應用SIET技術時需要十分注意。因為SIET技術的工作頻率在(0.1–10 Hz)之間，快速的離子變化SIET是檢測不到的，即使測到也將是瞬時的。因此，SIET技術不適合于檢測離子通道，而適合那些相對較慢的運輸機制，比如，與膜緊密相連的ATPases，以及一些不宜于被其他技術研究的系統。因此SIET的測量結果是運輸載體活性的反映，或膜運輸過程的結果，而不是單獨個別運輸載體的活性。

臺灣中研院應用SIET系統并結合顯微熒光染色技術對魚類卵黃細胞在從淡水到海水的雙向轉換過程中，氯離子細胞(ChlorideCells)吸收和釋放氯離子過程進行研究，為闡明遷徙魚類的離子調節機制提供了有利證據(見圖10)。

Fig.10 Combination usage of SIET with fluorescence microscopy.

圖10 SIET結合熒光顯微技術的SIET應用。

通過熒光染色定位Talipia(卵黃細胞yolk cell)氯細胞（左上）。魚鰓細胞熒光染色(B)及其對照(A)。Ca²⁺和Cl^-雙電極測量(右上)。 SIET的XZ平面測量(右下)。
美國麻省BayState醫院利用SIET對影響人體干細胞(StemCells)保存期限的若干外部環境及細胞內部因素進行研究，試圖克服由于冷凍造成的高達50％以上的損失率，為人體細胞培養，分化研究及人體器官再生掃清技術障隘(個人通訊)。

3.4. 神經生物學
在神經組織中，維持Ca²⁺濃度平衡、局部區域的反應及調控是極為重要的，如信號整合及臨床狀況等等 ^[27]。SIET技術在神經生物學的應用為研究運輸現象開辟了一條嶄新的道路。例如，在近乎實時的情況下，在細胞表面的運輸過程可以被較全面的記錄下來，以及由離子泵和其他運輸載體活性所產生的凈離子信號^[28,29]。

在單細胞研究中，Ca²⁺ 和H⁺選擇電極被應用于研究單個視網膜細胞^[30-35],而Knox等人利用 Aplysiid Bag Cell神經元作為材料研究在ICRAC、自由基、重金屬及第二信使存在的條件下，Ca²⁺ 的調節機制^[36,37]。Molina1等人2004年證明H⁺流動存在于skate視網膜細胞神經介質的生理活動中(見圖11) ^[38]。

Fig.11 H⁺ flux measurement in skate horizontal cells with SIET (based on [38], 2004).

圖11 SIET技術H⁺電極測量分離的skate Horizontal細胞(根據文獻[38]的圖修改)。

(A)通過酶解方法從skate retina得到的一個細胞。圖中左面H⁺電極正在靠近‘near pole’。雙箭頭代表從近端到遠端運動的位置；(B)加入25mM HEPES后H⁺流動減弱了；(C) 8個細胞測量的數據分析。

3.5. 臨床醫學
在牙齒周圍液體中的Ca²⁺濃度是決定一顆牙齒是在再礦化狀態還是在去礦化狀態的幾個關鍵因素之一^[39]。由于這些Ca²⁺指的是游離的Ca²⁺，而非陰離子結合的Ca²⁺，這就為Ca²⁺電極的應用提供了用武之地。

3.6. 藥理學
美國哈佛大學醫學研究院的研究人員正利用SIET技術，結合分子生物學方法對ChineseHamsterOvary細胞進行研究，試圖了解某些藥物的作用機理，闡明某些動物細胞的生化信號傳導路徑(個人通訊)。 美國北卡WAKE－FOREST醫學院MIKE TYTELL教授，應用SIET研究HSP70蛋白對動物神經細胞損傷修復的影響，以奠定HSP70可作為藥物的理論基礎(個人通訊)。

意大利的Rubinacci骨骼代謝研究所最近成功地利用SIET對Ca²⁺在骨中的代謝過程進行研究，不但證明了骨具有瞬時釋放Ca²⁺能力，而且為今后利用骨作為藥物測試的模式系統鋪墊了道路(見圖12)(論文在審閱過程中)。

Fig.12 Ca²⁺ activities in bone metabolism process measured by SIET.

圖12. SIET測量骨骼Ca²⁺釋放過程。

(a)顯微照片顯示跖骨metatarsal、穿過皮層cortex的穿孔及Ca²⁺電極；(b)當細胞外液(ECF)被不含Ca²⁺的細胞外液置換后，Ca²⁺在幾分鐘之內從內流轉變為外流�？拷鼤r間軸的數據為背景 對照；(c) 14次重復試驗的數據分析。
3.7. 傳染病學
美國麻省州立大學生物系KUNKEL教授利用SIET微測系統，對蟑螂體內的某一寄生蟲的產生和發育過程進行研究，試圖了解該寄生蟲引發兒童哮喘病的機理(個人通訊)。

3.8. 細胞生物學
Vincent等人在鑒定出擬南芥菜磷脂酰肌醇轉運蛋白族(Phosphatidylinositol transfer proteins (PITPs))的一種成份AtSfh1p之后，將顯微熒光技術與SIET結合使用，從內部和外部同時證明AtSfh1p在根毛頂端生長過程中，具有調節細胞內和質膜磷酸肌醇極性運輸，Ca²⁺信號傳遞和細胞骨架的功能。在植物細胞的極性生長機理研究方面向前推進了一步(見圖13)^[40]。

Fig.13 AtSfh1p deficiency Arabidopsis Ca²⁺ transportation in root hairs (based on [40], 2005).

圖13 AtSfh1p缺失擬南芥菜根毛的Ca²⁺信號傳遞異常(根據文獻[40]的圖修改)。

(A)Ca²⁺內部梯度.Ca²⁺濃度熒光顯微結果(左)野生型(右)突變體。(B)利用SIET測得的外部Ca²⁺流動情況。圖中箭頭同時代表Ca²⁺流動的方向和大小。(C)SIET15次獨立試驗結果的數據統計。
3.9. 環境科學
浮萍(Duckweed)具有積累和聚集水環境中重金屬離子（如：鎘）的作用，但其作用機理卻存在爭論，一方面認為浮萍本身具有吸收重金屬的功能，另一方面認為是與其共生的微生物使然。麻省州立大學微生物系(http://www.bio.umass.edu/micro/nusslein/stout.htm)應用SIET和Cd²⁺離子電極對該過程進行研究，有望為這一爭議提供新的有力證據。

3.10. 農業科學
新西蘭農業科學院利用SIET技術進行高吸收磷植物品種的篩選，試圖為改善植物品種摸索出一條新思路(個人通訊)。

土壤顆粒表面的離子組成及與周邊環境間的相互作用，對于土壤的性質起著決定性作用。SIET系統將為研究土壤顆粒的這一特性提供了非常直接和有效的手段(個人通訊)。

3.11. 太空生物學
北卡羅來納州立大學植物系NSCORT研究組受美國航空航天局資助，研究植物感知重力的遺傳及生理機理，通過對重力非敏感的擬南芥菜突變體的研究，許越等人發現植物根部在相對于地球重力不同的位置的情況下，其H⁺和Ca²⁺的流動在根部的不同位置呈現出不同的變化，顯示出H+和Ca²⁺可能在植物感知重力變化的過程中扮演一定的角色(文稿準備中)(見圖14)。

Fig.14 Simultaneous Ca²⁺/H⁺ measurement of ARG1 mutant.

圖14 利用SIET對重力非敏感植物突變體Ca²⁺及H⁺變化的同時測量。

(a)ARG(Altered Response to Gravity)擬南芥菜突變體及其野生型WS(擬南芥菜Wassilewskija品系)；(b)ARG在重力變化刺激下的 Ca²⁺及H⁺變化與野生型對照有明顯的區別；(c)針對植物重力研究而特殊設計的試驗系統。
3.12. 金屬腐蝕研究
某種單一離子流動對金屬腐蝕的影響已被越來越多的科研人員所關注。剛剛開始的這方面研究和數據的積累必將對金屬腐蝕機理的闡述具有深遠的意義(個人通訊)。

4. 總結及展望
SIET在借鑒眾多科學家工作經驗的基礎上，經過多年的改進和完善，為科研人員提供了一個較為友好的軟硬件環境，在數據的生成，采集以及校準等方面，極大地方便了研究人員。特別是應用SIET強大的3維立體測量方式，研究人員可以獲得其他電生理技術無法測到的被測樣品某些點的特異活性 ^[10]。

對于較為熟悉膜片鉗技術的科研人員來講，SIET是一個與膜片鉗無論在時間分辨率還是在空間分辨率上不同的技術（如圖1b），但由于膜片鉗技術似乎在研究離子通道之外，作為十分有限，兩者在研究過程中可以極好的相互補充。

由于SIET技術的出現，人們對于生物體特異離子轉運系統的研究，在靈敏度上，時間和空間分辨率上已經被大大地提高了，并已成熟地與細胞和分子生物學技術、其他電生理技術和顯微熒光成像技術配合使用(見3.5和4.10)。大家普遍認為SIET技術將在主動運輸離子或分子泵和協同運輸載體的研究方面發揮重大的作用。

分子遺傳學的進展使得我們能夠對這些運輸載體分子加以確定，克隆和進行可控制的表達。當這些運輸載體在分子水平方面通過在酵母，卵細胞等系統中的表達予以鑒定，或者某些細胞成份的物理結構和生理功能闡明之后^{[41,42,43,44]}，SIET技術的非損傷性，多離子/分子同時測量及靈活的空間測量方式將在細胞和組織水平上的功能鑒定方面發揮重要的，甚至是無法替代的作用。

5. 致謝
特別感謝匡廷云院士在身患重病的情況下對SIET技術的關心與支持。感謝楊福愉院士和林克椿教授給予的指導性建議。

同時感謝與裴真明教授(Department of Biology, Duke University, Durham, NC 27708)、王兆一教授(Creighton Cancer Center,1912 California St,Omaha, NE 68178)、許華曦教授(Center for Neuroscience and Aging, The Burnham Institute, La Jolla, California)、劉平生教授(Univ. of Texas Southwestern Medical Center at Dallas)、公衍道教授和隋森芳教授(清華大學生物科學與技術系)、徐濤教授，赫榮喬教授，沈鈞賢教授，黃有國教授(中國科學院生物物理所)、武維華教授(中國農業大學生物學院植物生理學與生物化學國家重點實驗室)、崔宗杰教授(北京師范大學細胞生物學研究所)、曾爭主任醫師(北京大學第一醫院感染疾病科)、 黃海長研究員(北京大學第一醫院腎臟內科-北京大學腎臟病研究所)、高天明教授(南方醫科大學)、高永雄教授(香港中文大學)、林澧儀(臺灣中央研究動物所)有關SIET技術所作的有益的探討。

對Applicable Electronics Inc.和Science Wares Inc.的資金和技術支持表示感謝。

6. 參考文獻
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Non-Invasive Scanning Ion-selective Electrode Technique and

Its Applications in the Post Genomic Era

Yue Xu^1,2,3) Joseph G. Kunkel³⁾ Alan Shipley⁴⁾ Ping Zhang⁵⁾ WANG Shi-Qiang⁶⁾

ZHANG Xu-Jia⁷⁾ HE Yi-Kun⁸⁾ YIN Li-Ping⁸⁾ YANG Huang-Tian⁹⁾ SHANGGUAN Yu¹⁾

YE Xin-Sheng¹⁰⁾

( ¹⁾YoungerUSA Company, P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA

²⁾Department of Botany, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695 USA

³⁾Vibrating Probe Facility, University of Massachusetts at Amherst, Amherst, MA 01003 USA

⁴⁾Applicable Electronics Inc., P.O. Box 589, Forestdale, MA 02644 USA

⁵⁾Department of Physiology, Yale University, New Haven, CT 06520 USA

⁶⁾Department of Physiology and Biophysics, State Key Lab of Biomembrane and membrane Biotech,

Peking University College of Life Sciences, Beijing 100871

⁷⁾National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences,

Beijing 100101

⁸⁾College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037

⁹⁾Institute of Health Science, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of

Sciences & Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025

¹⁰⁾Department of Life Sciences, National Natural Science Foundation of China, Beijing 100085 )

Abstract The SIET non-invasively measures both ionic concentrations and ionic fluxes in aqueous media with a spatial resolution of less than 10 micrometers with picomolar sensitivity. The SIET measures the extracellular fluxes in and out of living biological membranes in-vitro. Ca²⁺, H⁺, Cl^-, K⁺, Cd²⁺, Al³⁺, Mg²⁺, O₂ and NO are some of the ions/molecules that can be measured at present, and more ion and molecular species will be available in the near future. Some of the many applications of this technique for example, ionic flux measurements in both animal and plant cells demonstrate the unique advantages of the SIET compared to other techniques. The SIET can measure extra-cellular ion movement in such a way that it provides information that has been only theoretical.

Keywords non-invasive electrophysiology technique, ion-selective electrode, ionic transmemberane transportation, SIET

Corresponding Author. Yue (Jeff) Xu, YoungerUSA Co., PO Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA, E-mail: jeff@youngerusa.com

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