10X Genomics 公司的 Visium HD 是一種高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，空間分辨率可以達(dá)到2微米。
目前，這項(xiàng)技術(shù)可以檢測(cè)人和小鼠的全轉(zhuǎn)錄組。
并且，這項(xiàng)技術(shù)既可檢測(cè)新鮮樣本，也可以檢測(cè)FFPE石蠟切片樣本。


一、實(shí)驗(yàn)原理



一張芯片上有兩個(gè)樣本位。
每個(gè)樣本位，都是 6.5 * 6.5 mm 的放樣本的面積。一個(gè)樣本位是分成約 1100萬(wàn)個(gè)邊長(zhǎng)為 2 微米的小格子。
每個(gè)小格子上，都帶有特定空間標(biāo)簽序列的DNA標(biāo)簽鏈。





探針對(duì)的設(shè)計(jì)：每一對(duì)探針，都針對(duì)一個(gè)mRNA上相鄰的兩個(gè)位置。
如果樣本中有這個(gè)探針對(duì)的目標(biāo)mRNA，那么這個(gè)探針對(duì)就會(huì)雜交到目標(biāo)mRNA的相鄰位置上。
接下來(lái)，會(huì)在依賴RNA模板的DNA連接酶的作用下，把相鄰的兩個(gè)探針連接成一條DNA鏈。
這里，用連接反應(yīng)，來(lái)替代了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。連接反應(yīng)只需要有一小段目標(biāo)mRNA的片段，就能作為模板，完成連接反應(yīng)。這就繞開(kāi)了石蠟樣本中，mRNA降解成小片段的問(wèn)題。






在連接反應(yīng)完成之后，mRNA被用酶消化掉，對(duì)樣本進(jìn)行透化。
連接好的探針鏈，就會(huì)從樣本中滲透出來(lái)。
當(dāng)滲透出來(lái)的探針鏈遇到芯片上的標(biāo)簽鏈，探針鏈上的poly(A)就會(huì)和標(biāo)簽鏈上的poly(dT)互補(bǔ)雜交。
接下來(lái)，聚合酶會(huì)把探針鏈進(jìn)行延長(zhǎng)，并在探針鏈上加上標(biāo)簽鏈的序列。





加上了空間標(biāo)簽序列的探針鏈，被從芯片上洗脫下來(lái)，然后，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，變成高通量測(cè)序文庫(kù)。




文庫(kù)上機(jī)測(cè)序，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。


二、檢測(cè)結(jié)果展示

這是 10X Genomics 公司展示的部分樣本的檢測(cè)結(jié)果圖。


三、現(xiàn)成 panel



目前，有人和小鼠兩款接近于全基因組mRNA的檢測(cè)panel可用。
探針panel的設(shè)計(jì)，對(duì)每一個(gè)目標(biāo)mRNA，設(shè)計(jì)三對(duì)左右的雜交探針對(duì)。這樣設(shè)計(jì)，可以提高對(duì)目標(biāo)mRNA的檢出率。
針對(duì)人的panel，設(shè)計(jì)的探針覆蓋18000個(gè)基因，因?yàn)槿祟愐还彩?萬(wàn)個(gè)基因，所以這個(gè)針對(duì)人類的panel接近于可以檢測(cè)到全部的人類基因mRNA。
針對(duì)小鼠的panel，覆蓋19000個(gè)基因，這就可以檢測(cè)到絕大多數(shù)的小鼠基因的mRNA。
 

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