服務(wù)流程

 
 

服務(wù)說(shuō)明

 
 

細(xì)胞增殖是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳的基礎(chǔ)，是細(xì)胞最基本的生理活動(dòng)。生長(zhǎng)因子、激素及癌基因產(chǎn)物等均可誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖或抑制細(xì)胞的增殖，通過(guò)影響細(xì)胞周期的運(yùn)行、細(xì)胞凋亡的改變而實(shí)現(xiàn)。

 

MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

MTT為一種化合物，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide。MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在 490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，因此MTT的吸光值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。
吉?jiǎng)P實(shí)驗(yàn)實(shí)例： 
不同基因的過(guò)表達(dá)慢病毒感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)三天后，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，向96孔板每孔加入2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育至細(xì)胞貼壁,向孔板中加入MTT溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)4h。最后去除MTT，加入二甲基亞砜溶解MTT，酶標(biāo)儀讀取OD490時(shí)的吸光值。
 
CON：未處理細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組；
NC：對(duì)照慢病毒感染實(shí)驗(yàn)組；
OE：目的基因過(guò)表達(dá)慢病毒感染實(shí)驗(yàn)組。
結(jié)論：目的基因過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：2250元/組，MTT檢測(cè)在96孔板中進(jìn)行，60孔為一組實(shí)驗(yàn)。

 

克隆形成實(shí)驗(yàn)

是測(cè)定細(xì)胞的增殖能力的有效方法之一。單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群稱為克隆。這時(shí)每個(gè)克隆含有50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3~1.0mm之間，通過(guò)計(jì)數(shù)克隆形成率，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力做定量分析，了解細(xì)胞的增殖能力和獨(dú)立生存能力。常用的方法有：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂形成實(shí)驗(yàn)。
吉?jiǎng)P基因?qū)嶒?yàn)實(shí)例： 
 1、平板克隆形成：分別將陰性對(duì)照靶點(diǎn)和目的基因有效靶點(diǎn)慢病毒感染細(xì)胞，四天后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)后在6孔板培養(yǎng)板中接種500個(gè)細(xì)胞/孔，靜置培養(yǎng)2周，中途隔3天換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆即終止培養(yǎng)，用多聚甲醛固定1h，再用Giemsa染色后，計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
  
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：感染了目的基因靶點(diǎn)病毒的細(xì)胞，克隆形成能力減弱。
2、軟瓊脂克隆形成：分別將陰性對(duì)照靶點(diǎn)和目的基因有效靶點(diǎn)慢病毒感染細(xì)胞，四天后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化；在孔板底部鋪0.6%的瓊脂糖，上層使用0.3%的瓊脂糖和細(xì)胞的混液，置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10天。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
  
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：感染了目的基因靶點(diǎn)病毒的細(xì)胞，克隆形成能力減弱。
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：375元/well。

 

細(xì)胞周期

指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，最常用的是PI滲入測(cè)定細(xì)胞周期。PI ,即碘化丙錠,可以與細(xì)胞內(nèi)DNA 和RNA 結(jié)合,采用RNA酶將RNA消化后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA 結(jié)合的PI 的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA 含量不同,通常正常細(xì)胞的 G0/G1 期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N) ,而G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA 含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為 G0/G1 期,S 期和G2/ M 期,并可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。
應(yīng)用實(shí)例 
分別將陰性對(duì)照靶點(diǎn)和目的基因有效靶點(diǎn)慢病毒感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)四天后，洗滌消化并用預(yù)冷的70% 乙醇溶液固定細(xì)胞，1h后，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，得到的周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
 
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：感染目的基因靶點(diǎn)病毒后，細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞顯著增加，處于S期的細(xì)胞顯著減少，提示目的基因與細(xì)胞的周期分布顯著相關(guān)。
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：375元/well。

 

細(xì)胞凋亡

是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過(guò)程。細(xì)胞凋亡的過(guò)程大致可分為以下幾個(gè)階段：接受凋亡信號(hào)→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過(guò)程。
原理：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS)遷移至細(xì)胞膜外測(cè)。磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它于PS具有高度的結(jié)合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞外測(cè)的磷脂酰絲氨酸。故利用對(duì)PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標(biāo)記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），用流式細(xì) 胞儀即可檢測(cè)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏；Annexin V染色法不需固定細(xì)胞，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V法更加省時(shí)，簡(jiǎn)單，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。
吉?jiǎng)P實(shí)驗(yàn)實(shí)例： 
誘導(dǎo)凋亡藥物紫杉醇處理乳腺癌MCF7細(xì)胞8小時(shí)后，消化并收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞三次，加入annexin V-APC染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。  
 
  

左圖為對(duì)照組，右圖為加藥處理組
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：Annexin V單染實(shí)驗(yàn)費(fèi)：375元/well；Annexin V和PI雙染實(shí)驗(yàn)費(fèi)：460元/well

 

 

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